海洋生物中蕴藏着巨大的生物活性物质资源 ,其中有些生物活性物质具有重要的药用价值 ,已成为人类治愈疾病的重要药物资源 ,因此 ,开发海洋生物中的活性物质是国内外的热门研究课题 (张克凌等 ,2 0 0 0 ;张新宇等 ,2 0 0 0 )。近几年 ,国外已开发出的海洋肽类活性物质有活性毒肽、抗菌肽、抗癌肽等 (Ｐｅｔｔｉｔｅｔａｌ,1 989;Ｐｅｔｔｉｔｅｔａｌ,1 995)。目前 ,由于臭氧层的破坏 ,照射到地球上的射线过多 ,对机体造成损伤 ,甚至导致肿瘤的发生 (Ｃｌｅｍｅｎｔｅｔａｌ,1 996) ,因此 ,寻找天然抗氧化剂、阻止紫外线的氧化损伤是国际上的重要研究课题。扇贝多肽是近年来从栉孔扇贝中提取出的一种具有生物活性的小分子、水溶性多肽 ,分子量为80 0— 1 0 0 0。初步研究表明该多肽具有抗氧化活性 ,能清除羟自由基和超氧阴离子 (王春波等 ,1 998ａ) ,有延缓自然衰老动物皮肤的老化的作用 (王春波等 ,1 998ｂ)。但扇贝多肽是否对免疫细胞的功能有影响 ?对免疫细胞有无抗紫外线氧化损伤的保护作用 ?目前尚未见报道。本文探讨在紫外线辐射损伤条件下扇贝多肽对免疫细胞的保护作用 ,并探讨扇贝多肽对胸腺细胞和脾细胞活性的影响 ,以期为扇贝多肽的进一步开发应用提供资料。1 材料与方法1 .1 材料6周龄健康雄性Ｗｉｓｔａｒ大鼠 1 0只 ,购于青岛药物研究所实验动物中心 ,在无特殊病原菌的条件下喂养。扇贝多肽由中国水产科学研究院黄海水产研究所提供。ＲＰＭＩ 1 640、噻唑盐 (ＭＴＴ)均为Ｓｉｇｍａ公司产品。1 .2 方法1 .2 .1 紫外线对免疫细胞损伤强度和扇贝多肽有效保护剂量的筛选 采用噻唑盐(ＭＴＴ)比色法 (司徒镇强等 ,1 996)。首先无菌取大鼠胸腺和脾 ,按常规方法分别制备胸腺细胞 (Ｔｈｙｍｏｃｙｔｅ,Ｔ)和脾细胞 (Ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅ,Ｓ) ,调其细胞浓度为 1× 1 0 6 — 5× 1 0 6 ｃｅｌｌ/ｍｌ,经台盼蓝染色检查细胞活性大于 95%。分 6组 ,接种于 2 4孔板 ,每孔 1ｍｌ,每组 3个复孔 ,有两组分别加入含 8%小牛血清的ＲＰＭＩ -1 640培养液 (完全培养液 ) ,作为对照组(Ｃ1和Ｃ2 )。另外 4组分别加入不同浓度的扇贝多肽 ,使其终浓度为 1 .0 %、2 .5%、5.0 %和 1 0 .0 %。孵育 1 2ｈ。其中对照组 1 (Ｃ1)的细胞不经紫外线损伤 ;对照组 2 (Ｃ2 )与加入不同浓度扇贝多肽的实验组在紫外线下分别照射 2 0ｓ和 4 0ｓ,其辐射强度分别为 6× 1 0 - 4Ｊ/ｃｍ2 和 1 .2× 1 0 - 3Ｊ/ｃｍ2 。然后向各组每孔加入ＭＴＴ溶液 1 0 0 μｌ,37℃继续孵育 4ｈ ,终止培养。离心弃去孔内营养液 ,收集细胞 ,每孔加入 1 50 μｌ二甲基亚砜 (ＤＭＳＯ) ,振荡1 0ｍｉｎ ,选择 4 90ｎｍ波长 ,在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值 ,记录结果 (ＯＤ值 ) ,以完全培养液孔作空白对照。1 .2 .2 在紫外线损伤过程中扇贝多肽对胸腺细胞和脾细胞的保护作用 按上述方法取胸腺和脾细胞 ,调细胞悬液浓度为 1× 1 0 6 ｃｅｌｌ/ｍｌ分组备用。细胞悬液分为 4组 ,接种于 2 4孔板 ,每孔 1ｍｌ,每组 3个复孔 ,分别加入ＲＰＭＩ -1 640作为对照 (Ｃ)和按筛选后的浓度分别加入扇贝多肽 ,扇贝多肽的终浓度分别为 0 .5%、1 .0 %和 2 .0 % ,孵育 1 2ｈ。在强度分别为 3.0× 1 0 - 5 Ｊ/ｃｍ2 、1 .2× 1 0 - 3Ｊ/ｃｍ2 、1 .2 6× 1 0 - 2 Ｊ/ｃｍ2 的紫外线照射后 ,以同上方法检测扇贝多肽对胸腺和脾细胞的保护作用。1 .2 .3 扇贝多肽对胸腺和脾细胞的影响 分离胸腺和脾细胞 ,调细胞悬液浓度为 1×1 0 6 ｃｅｌｌ/ｍｌ。一部分细胞悬液不加刀豆素蛋白Ａ(ＣｏｎＡ) (Ｔ0 或Ｓ0 组 ) ,分为 6组 ,每组 3个复孔 ,每孔 1ｍｌ,一组加入ＲＰＭＩ-1 640液作为对照 (Ｃ) ,另三组分别加入终浓度为 0 .5%、1 .0 %和 2 .0 %的扇贝多肽 ;第 5组加入 1 .0 %的雌二醇 (Ｅｓｔｒａｄｉｏｌ,Ｅ2 ) ,第 6组加入终浓度皆为 1 .0 %的Ｅ2 和扇贝多肽。另一部分胸腺和脾细胞悬液分别加入 2ｎｇ/ｍｌ和 6ｎｇ/ｍｌ的ＣｏｎＡ后 (Ｔｃ 或Ｓｃ 组 ) ,再按上述分组分别加入同样试剂。以ＭＴＴ方法检测扇贝多肽对有有丝分裂原和无有丝分裂原刺激时的免疫细胞活性的影响。2 结果2 .1 扇贝多肽最佳保护剂量的选择实验中 ,肉眼即可观察到胸腺细胞较脾细胞更易受到紫外线的氧化损伤 ,照射后马上出现细胞凝集 ,脾细胞出现凝集较晚。与不经紫外线照射的Ｃ1组相比 ,Ｃ2 组的细胞经紫外线照射后胸腺细胞和脾细胞的代谢活性均降低 ;但是照射 4 0ｓ( 1 .2× 1 0 - 3Ｊ/ｃｍ2 )较照射 2 0ｓ( 6.0× 1 0 - 4Ｊ/ｃｍ2 )的代谢活性降低的程度要轻。加入扇贝多肽组的两种细胞的活性均较不加扇贝多肽组的细胞活性强 ;但是对脾细胞 ,浓度为 1 .0 %的扇贝多肽保护作用较 2 .5%的为强 ;而对胸腺细胞 ,浓度为 2 .5%的扇贝多肽保护作用最佳 (表 1 )。2 .2 紫外线氧化损伤条件下扇贝多肽对免疫细胞的保护作用根据筛选的结果 ,选择 2 .0 %和 1 .0 %及其 0 .5%三个浓度作为最佳保护浓度 ,在紫外线辐射强度较低时加以上 3个浓度扇贝多肽组的细胞活性均较不加扇贝多肽的活性强 ;但是紫外线辐射的强度增加到 5.4× 1 0 - 2 Ｊ/ｃｍ2 时 ,仅 2 .0 %浓度的扇贝多肽对胸腺细胞具有保护作用 ,而 1 .0 %、2 .0 %浓度的扇贝多肽对脾细胞均有保护作用 (表 2 )。表 1 紫外线损伤过程中扇贝多肽对免疫细胞有效保护剂量的筛选Ｔａｂ.1 Ｃｈｏｉｃｅｏｆｐｒ ｏｔｅｃｔｉｖｅｅｆｆｅｃｔｄｏｓｅｏｆｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓｆｒｏｍＣｈｌａｍｙｓ ｆａｒｒｅｒｉｏｎｉｍｍｕｎｅｃｅｌｌｓｄｕｒｉｎｇｔｈｅｐｒｏｃｅｓｓｏｆＵＶｏｘｉｄａｔｉｖｅｄａｍａｇｅ免疫细胞活性(ＯＤ)组别 辐照强度 (Ｊ/ｃｍ2 )6.0× 1 0 - 41 .2× 1 0 - 3脾细胞 Ｃ1(未照 ) 0 .685± 0 .0 0 6 Ｃ2 0 .390± 0 .0 0 51) 0 .663± 0 .0 1 1 1)1 .0 % 0 .81 4± 0 .0 1 0 1) 1 .0 4 1± 0 .0 4 3 1)2 .5% 0 .70 3± 0 .0 0 8 1) 0 .84 2± 0 .0 0 9 1)5.0 % 0 .976± 0 .0 1 4 1) 1 .2 37± 0 .0 2 7 1)1 0 .0 % 1 .796± 0 .0 1 3 1) 2 .1 61± 0 .0 51 1)胸腺细胞 Ｃ1(未照 ) 0 .72 6± 0 .0 1 3 Ｃ2 0 .4 37± 0 .0 1 0 1) 0 .62 8± 0 .0 0 81)1 .0 % 1 .70 4± 0 .0 1 9 1) 2 .661± 0 .0 2 2 1)2 .5% 2 .659± 0 .0 37 1) 3 .0 1 8± 0 .0 1 1 1)5.0 % 1 .684± 0 .0 30 1) 2 .0 67± 0 .0 1 1 1 0 .0 % 2 .2 0 6± 0 .0 1 5 1) 2 .582± 0 .0 71 1) Ｐ <0 .0 1 , Ｐ <0 .0 5,与Ｃ2 组相比 (ＣｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈＣ2 ｇｒｏｕｐ) ;1 )Ｐ <0 .0 5,与Ｃ1组相比 (ＣｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈＣ1ｇｒｏｕｐ)表 2 不同紫外线损伤强度下扇贝多肽对免疫细胞的保护作用Ｔａｂ .2 Ｔｈｅａｎｔｉ ＵＶｏｘｉｄａｔｉｖｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓｆｒｏｍＣｈｌａｍｙｓｆａｒｒｅｒｉｏｎｉｍｍｕｎｅｃｅｌｌｓ免疫细胞活性 (ＯＤ) 组别 辐照强度 (Ｊ/ｃｍ2 )2 .1× 1 0 - 41 .2× 1 0 - 3 5.4× 1 0 - 2胸腺细胞Ｃ 0 .1 71± 0 .0 1 0 0 .380± 0 .0 0 7 0 .356± 0 .0 370 .5% 0 .334± 0 .0 0 1 0 .4 51± 0 .0 1 4 0 .373± 0 .0 1 81 .0 % 0 .540± 0 .0 1 0 0 .4 72± 0 .0 1 1 0 .358± 0 .0 2 72 .0 % 0 .70 1± 0 .0 1 5 0 .578± 0 .0 2 1 0 .551± 0 .0 30 脾细胞Ｃ 0 .540± 0 .0 2 3 0 .355± 0 .0 0 4 0 .30 6± 0 .0 1 40 .5% 0 .672± 0 .0 1 5 0 .395± 0 .0 0 2 0 .30 2± 0 .0 0 91 .0 % 0 .774± 0 .0 2 4 0 .4 1 9± 0 .0 1 2 0 .384± 0 .0 1 1 2 .0 % 0 .91 2± 0 .0 2 1 0 .52 6± 0 .0 1 4 0 .4 67± 0 .0 1 6 Ｐ <0 .0 1 ,
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