多糖是自然界含量最丰富的物质之一,也是与人类生活紧密相关的一类生物高分子化合物。随着生物 化学研究技术的发展,人们对活性多糖的生物功能有了新的认识。大量的研究表明,茶多糖(te apolysaccharides,TPS)具有防辐射、抗凝血及抗血栓、降血糖、增强机体 免疫力、降血压、降血脂、耐缺氧及增加冠状动脉血流量等多种生物学功能<1>,TPS成为茶 叶中极具开发利用价值的又一种生物活性物质。本文研究了富硒茶叶中TPS的某些化学性质及清 除羟基自由基的活性。1 材料和方法1.1 材料和试剂茶叶为湖北宣恩县富硒源茶厂生产;D -脱氧核糖为Sig-ma产品;Pullulan系列为日本东京化成公司产品;其余试剂均为 国产分析纯。1.2 仪器UV-265FW紫外可见分光光度计;Alpha-I-5真空冷冻 干燥机;Shimadzu-G-9A气相色谱仪;Waters高效液相色谱仪。1.3 TP S的提取制备干茶叶磨碎,用70℃温水浸提,浸提液浓缩,乙醇沉淀,沉淀经丙酮、乙醚、无水 乙醇交替洗涤,Sevag法脱蛋白至萃取界面无乳白色物质产生。经自来水和蒸馏水透析后上D EAE-cellulose柱,收集主要多糖组分,经透析,冷冻干燥得到TPS纯品。1.4 测定方法TPS中的中性糖含量测定采用苯酚—硫酸法;蛋白质含量测定采用考马斯亮蓝比色法 ;半乳糖醛酸含量测定采用咔唑—硫酸法。1.5 分子量测定采用高效液相色谱法。色谱条件: 仪器:WatersHPLC仪;标准品:Pullulan系列;柱:TSKG3000SW。 检测器:示差折光仪;流动相:0.2mol/L醋酸—醋酸钠缓冲液;流速:1.0ml/mi n。1.6 TPS中糖组成的测定采用气相色谱法。取经纯化的TPS20mg于管中,加2m ol/L三氟乙酸4ml封管,140℃水解4h,然后挥干三氟乙酸,加水重复几次直至检测为 中性,减压浓缩,冷冻干燥。称取10mg干燥的样品,加入0.5ml吡啶摇动使其溶解,再加 入0.4ml六甲基二硅烷和0.2ml三甲基氯硅烷,室温反应5min,反应产物可直接进行 气相色谱分析。色谱条件:3mm×2m不锈钢柱,担体为ChromosorbW(60—80 目),5%SE—30固定液,氢火焰离子化检测器,记录仪:C-R6A积分仪,柱温180℃ ,进样口温度230℃,空气流速500ml/min,氢气流速50ml/min,氮气流速2 0ml/min。1.7 TPS对羟基自由基的清除作用采用D-脱氧核糖-铁体系法<2>。 将不同浓度样品,0.4mlKH2PO4-KOH缓冲液(pH=7.4),0.1mlFeC l3(100μmol/L),0.1mlEDTA(104μmol/L),0.1mlH2O 2(1mmol/L),0.1mlD-脱氧核糖(60mmol/L,对照以蒸馏水代替),0 .1ml抗坏血酸(100μmol/L)的混合物于37℃保温1h,再加入1ml25%HC l和1%硫代巴比妥酸(TBA)各1ml,沸水浴15min,冷却,于532nm测定吸光值 。·OH清除率(%)=A0(A1-A2)A0×100其中:A0:未加清除剂的吸光值;A 1:加入清除剂后的吸光值;A2:试剂空白的吸光值。2 结果2.1 TPS的组成分析对纯 化后的TPS进行了组成分析,发现其不含多酚、咖啡因等物质。其主要化学组成如表1所示。表 1 TPS的化学组成测定指标TPS测定指标TPS单糖所占摩尔百分比(mol.%)重均分 子量(MW)117000阿拉伯糖41.6中性糖含量(%)51.7核糖2.9己糖醛酸(% )8.8木糖6.0蛋白质(%)3.9葡萄糖38.1半乳糖11.32.2 TPS对羟基自 由基的清除作用在D-脱氧核糖-铁体系中,TPS明显能清除·OH,结果如表2所示,当TP S浓度范围在8.5～170mg/L时,清除率为5.5%～74.7%,呈剂量-效应关系, r=0.945,IC50=96.1mg/L。表2 不同浓度TPS对羟基自由基的清除作用 %TPS浓度(mg/L)8.517.025.534.042.585.0127.5170 .05.511.619.630.240.655.958.974.73 讨论TPS经反复 脱蛋白,DEAE-cellulose进一步分离纯化,仍含有3.9%的蛋白质和8.8%的 己糖醛酸,这一结果显示,TPS为一酸性糖蛋白,这与文献报道基本一致<3,4>。本研究所 得到TPS重均分子量(weigth-averagemolecularweigth)为1 17000,其单糖组成为:阿拉伯糖∶核糖∶木糖∶葡萄糖∶半乳糖=41.6∶2.9∶6. 0∶38.1∶11.3。而在以往的研究中,清水岑夫从茶叶中分离的TPS分子量为4000 0<5>,王丁刚等则报道TPS分子量为91000<6>,汪东风等得到分子量为10700 0的TPS<6>,而Tadakazu等发现茶中含有分子量在100000以上(A)和平均 分子量为10000(B)的2种多糖<7>。各报道均不一致,这可能与茶叶原料和提取方法有 关,同时也说明TPS稳定性较差,易于随各种影响因子而改变。在D-脱氧核糖-铁体系中,首 先是Fe2+-EDTA在磷酸盐缓冲液(pH7.4)中与H2O反应引发·OH,·OH与D -脱氧核糖反应形成色素,再与TBA在酸性加热的条件下形成丙二醛(MDA),而加入TPS 样品后,MDA的形成明显减少,说明TPS可与D-脱氧核糖竞争·OH,从而达到清除自由基 的目的。其作用机制可能是TPS中的一些活性位点与·OH结合,或TPS本身大分子对·OH 产生包合作用,其具体作用机理还有待于进一步深入研究。富硒茶叶中茶多糖的某些化学性质及对 羟自由基的清除作用@陈海霞$华中农业大学食品科技系!武汉430070@谢笔钧$华中农业 大学食品科技系!武汉430070茶多糖;;化学性质;;活性氧自由基研究了茶多糖(TPS )的某些化学性质及其对活性氧自由基的清除作用。结果表明:TPS是一类与蛋白质结合在一起的酸性糖蛋白,其多糖部分是由阿拉伯糖、核糖、木糖、葡萄糖及半乳糖组成;在D-脱氧核糖—铁体系中,TPS(8.5～170)mg/L对·OH的清除率为5.5%～74.7%。1 汪东风,谢晓凤 ,王银龙 .茶叶多糖及其药理作用研究进展 .天然产物研究与开发 ,1996 ,(1) :6 3— 6 7
2 Barry H,John M,Okezie I.The deoxyribose method:a simple“Test-Tube”assay for determination of rate constants for reac-tions of hydroxyl radicals.Anal Biochem,1987,(16 5 ) :2 15— 2 19
3 Isiguki K,Takakuwa T,Takeo T. Anti-diabeties mellitus effectof water-soluble tea polysaccharide. In:Proceedings of Interna-tional Symposium on Tea Science,1991. Shizuka:The OrganizingCommittee of ISTS,1992 ,2 40— 2 41
4 李布青 ,张慧玲 ,舒庆龄 ,等 .中低档绿茶中茶多糖的提取及降血糖作用 .茶叶科学 ,1996 ,16 (1) :6 7— 72
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