补阳还五汤是中医经典方剂 ,源于清代王清任《医林改错》。它对治疗脑中风有显著疗效。该方由黄芪 12 0ｇ ,当归尾 6ｇ ,赤芍 4 .5ｇ ,川芎 3ｇ ,红花 3ｇ ,桃仁 3ｇ ,地龙 3ｇ 7味药组成。据中医理论 :方中黄芪为主 ,可补气升阳。归尾、赤芍、川芎为辅 ,当归、川芎有活血止痛的作用 ,赤芍可清热凉血。红花、桃仁为佐。地龙为使。长期的实践虽已明确了方中各味药主、辅、佐、使的地位与作用。但由于受历史和技术条件的限制 ,至今还未对该方中各味药治疗脑中风的分子机制进行深入定性、定量的研究。已有文献<1～ 4 > 研究上述各味药物的一些有效成分 ,如黄芪甲苷、阿魏酸、川芎嗪、丹皮酚、槲皮素、毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷、绿原酸等的药理作用 ,但这些成分在同一方剂中对同一种疾病的药理作用比较 ,作者还未见报道。脑中风是脑血管和脑血液循环发生障碍引起的神经系统疾患。它在细胞水平的病理表现与“缺血—再灌”损伤相似。松本等<5> 证实脑“缺血 再灌”损伤是研究脑中风疾病较好的实验模型。过去的研究已证实“缺血 再灌”可使细胞膜流动性降低<6 > 。膜流动性是细胞的重要的生物物理性质之一。本实验用自旋标记ＥＳＲ法测试细胞膜流动性 ,用以分析和验证中药复方的配伍机制。1 材料与方法1.1 药物与试剂1.1.1 药材 黄芪为豆科植物蒙古黄芪 <Ａｓｔｒａｇａｌｕｓｍｅｍｂｒａｎａｃｅｕｓｖａｒ .ｍｏｎｇｈｏｌｉｃｕｓ(Ｂｇｅ .)Ｈｓｉａｏ>的干燥根 ,一级品 ,1999年 9月购于山西省浑源县药材公司。归尾为伞形科植物当归 <Ａｎｇｅｌｉｃａｓｉｎｅｎｓｉｓ(Ｏｌｉｖ .)Ｄｉｅｌｓ>的干燥侧根 ,一级品 ,1999年 10月购于甘肃岷县医药公司。赤芍为毛茛科植物芍药 (Ｐａｅｏｎｉａｌａｃｔｉ ｆｌｏｒａＰａｌｌ .)的干燥根 ,一级品 ,1998年 9月购于内蒙古多伦县医药公司。川芎为伞形科植物川芎(ＬｉｇｕｓｔｉｃｕｍｃｈｕａｎｘｉｏｎｇＨｏｒｔ.)的干燥根茎 ,一级品 ,1999年 10月购于四川省成都荷花池药材市场。红花为菊科植物红花 (ＣａｒｔｈａｍｕｓｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓＬ .)的干燥花 ,一级品 ,1999年 10月购于新疆药材公司。桃仁为蔷薇科植物桃 <Ｐｒｕｎｕｓｐｅｒｓｉｃａ (Ｌ .)Ｂａｔｓｃｈ>的干燥成熟种子 ,一级品 ,1999年 10月购于河北省安国药材市场。地龙为矩蚓科动物参环毛蚓 <Ｐｈｅｒａｔｉｍａａｓ ｐｅｒｇｉｌｌｕｍ (Ｐｅｒｒｉｅｒ) >的干燥体 ,一级品 ,1998年 9月购于广东省药材公司。以上药材均经作者鉴定 ,样品凭证标本存于北京大学药学院天然药物学系生药标本室。1.1.2 补阳还五汤的制备 上述 7种药材按方剂比例称重混合 ,依次用 10倍量、8倍量、6倍量水煎煮 3次 ,每次 1ｈ。提取液合并 ,浓缩并冷冻干燥得冷干粉备用 ,得率 31%。1.1.3 补阳还五汤化学成分 其纯品有效成分黄芪甲苷 (ａｓｔｒａｇａｌｏｓｉｄｅⅣ ,Ｃ4 0 Ｈ6 4Ｏ14 ,相对分子质量Ｍｒ76 8,Ｎｏ .0 781 970 6 )、阿魏酸 (ｆｅｒｕｌｉｃａｃｉｄ ,Ｃ10 Ｈ10 Ｏ4 ,Ｍｒ194 .18,0 773 9910 )、盐酸川芎嗪 (ｃｈｕａｎｘｉｏｎｇｚｉｎｅｈｙ ｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄ ,Ｃ8Ｈ12 Ｎ2 ·ＨＣｌ,Ｍｒ 172 .2 0 ,0 817 980 3)、芦丁(ｒｕｔｉｎ ,Ｃ2 7Ｈ30 Ｏ16 ,Ｍｒ 6 10 .51,0 0 80 970 5)、绿原酸(ｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃａｃｉｄ ,Ｃ16 Ｈ18Ｏ9,Ｍｒ 354,0 753 9910 )、丹皮酚 (ｐａｅｏｎａｌ,Ｃ9Ｈ10 Ｏ3,Ｍｒ 16 6 .18,0 70 8 970 4 )、槲皮素(ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ ,Ｃ15Ｈ10 Ｏ7,Ｍｒ 30 2 .2 3,0 0 81 930 4 )和芍药苷(ｐａｅｏｎｉｆｌｏｒｉｎ ,Ｃ2 3Ｈ2 8Ｏ11,Ｍｒ 4 80 .4 5,0 736 9912 )购于中国药品生物制品检定所 ,所有样品纯度 98%以上。毛蕊异黄酮苷 (ｃａｌｙｃｏｓｉｎ 7 Ｏ ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ ,Ｃ2 2 Ｈ2 2Ｏ10 ,Ｍｒ 4 4 6 )、毛蕊异黄酮 (ｃａｌｙｃｏｓｉｎ ,Ｃ16 Ｈ12 Ｏ5,Ｍｒ2 84 )、紫檀烷苷 (9,10 ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ ｐｔｅｒｏｃａｒｐａｎｅ 7 Ｏ β Ｄ-ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ ,Ｃ2 3Ｈ2 6 Ｏ10 ,Ｍｒ 4 6 2 )和芒柄花素 (ｆｏｒ ｍｏｎｏｎｅｔｉｎ ,Ｃ16 Ｈ12 Ｏ4 ,Ｍｒ 2 6 8)为作者从补阳还五汤水煎液中分得。1.1.4 试样的制备 补阳还五汤冷干粉用生理盐水 (ＮＳ)配制成 2 0 0ｍｇ·ｍＬ- 1。川芎嗪ＮＳ配制两个浓度 ,分别为 2× 10 - 4ｍｏｌ·Ｌ- 1和 8× 10 - 6 ｍｏｌ·Ｌ- 1。其余药物ＮＳ配制成 2× 10 - 4ｍｏｌ·Ｌ- 1。自旋标记物5ＤＳ(5 ｄｏｘｙｌ ｓｔｅａｒｌｉｃａｃｉｄｍｅｔｈｙｌｅｓｔｅｒ)购自Ｓｉｇｍａ公司 ,使用终浓度 4× 10 - 5ｍｏｌ·Ｌ- 1。其余试剂均为分析纯。Ｄ Ｈａｎｋｓ液作为细胞液 ,用时加入葡萄糖 1ｇ·Ｌ- 1。1.2 动物♂Ｗｉｓｔａｒ大鼠 ,体重 170～ 190ｇ ,由北京大学医学部实验动物中心提供。1.3 细胞制备将大鼠随机分成实验损伤组 (Ｄ)与对照组 (Ｃ) ,其中Ｄ组乌拉坦 (12 0 0ｍｇ·ｋｇ- 1,ｉｐ)麻醉后 ,分离双侧颈总动脉并结扎 30ｍｉｎ后再灌流 2ｈ ,然后开颅取全脑 ,冰浴环境下将脑组织纵向切开 ,一半用福尔马林固定制作组织切片 ,另一半剔除脑膜 ,Ｄ Ｈａｎｋｓ液洗去血污置 10 0目筛网中剪碎使分离成单细胞 ,倒置显微镜下细胞记数并经低温离心将细胞调至 5～8× 10 7个·ｍＬ- 1。台盼蓝染色证实细胞成活良好。正常大鼠作为对照 ,在乌拉坦麻醉下直接取脑组织。余下步骤同上。1.4 ＥＳＲ检测参照文献 <7>完成脑细胞自旋标记 ,对标记后的损伤组和对照组细胞 6 0 0 μＬ ,分别加入ＮＳ及各种药物 2 4 0 μＬ ,Ｄ Ｈａｎｋｓ缓冲液 156 0 μＬ。并继续 2 5℃温育 150ｍｉｎ ,离心洗涤至上清液中无游离的自旋标记物 ,取沉淀装入石英毛细管内 ,用ＢｒｕｋｅｒＥＳＰ 30 0电子顺磁共振波谱仪常温下检测。仪器参数设置如下 :微波功率 10ｍＷ ,调制频率 10 0ｋＨｚ ,调制幅度0 .2ｍＴ ,中心磁场 349ｍＴ ,扫宽 2 0ｍＴ。从ＥＳＲ波谱图上计算细胞膜的有序性参数Ｓ<7> ,它与流动性的倒数相关 ,实验重复 5次。统计方法用组间ｔ检验 , ｘ±ｓ表示。2 结 果2 .1 组织观察与正常脑组织切片对照 ,损伤组大鼠脑组织切片呈病理形态学改变。即 :可见大脑皮层区局灶性出血 ,神经元细胞染色加深 ,细胞核界限模糊 ,核蛋白弥散 ,胞浆中有空泡出现 ,伴水肿发生。部分小脑梨状细胞形态不完整。对游离细胞进行台盼蓝染色 ,证实细胞存活率在 95%以上。这些现象表明 ,本实验用缺血 30ｍｉｎ 再灌 2ｈ作为大鼠脑中风实验模型是成功的。2 .2 ＥＳＲ检测细胞膜流动性损伤组与对照组加入ＮＳ及各种药物后分别测得损伤组的序参数Ｓｘ 与对照组的序参数Ｓ0 值见表1。Ｄ与Ｃ的ＮＳ组比较 ,Ｓ值具显著性差异 (Ｐ <0 .0 0 1) ,表明细胞受到损伤后膜流动性减小。Ｄ组加入各种药物 ,除高浓度川芎嗪外 ,各种药物均可使细胞膜流动性增大 (Ｐ <0 .0 1) ,其流动性改变趋向于正常脑细胞水平。但是各种成分对流动性的影响各不相同。Ｄ组Ｓ值越小 ,表明药物引起损伤细胞膜流动性变化越大 ,药效越强。药物诱导损伤细胞恢复至正常的能力 (与生理盐水组比较 )依次为低浓度川芎嗪、阿魏酸、黄芪甲苷、芦丁、补阳还五汤、绿原酸、丹皮酚、毛蕊异黄酮苷、毛蕊异黄酮、紫檀烷苷、槲皮素、芍药苷和芒柄花素。Ｃ组除高浓度川芎嗪外 ,各加药组细胞膜流动性无显著性变化 (Ｐ >0 .0 1) ,提示各药物对正常细胞无明显影响而对损伤细胞膜流动性有改善作用。实验中发现高浓度川芎嗪使正常细胞膜流动性减小 (Ｐ <0 .0 0 1) ,但对损伤细胞膜流动性无作用 (Ｐ >0 .0 1) ,即高浓度川芎嗪对正常细胞造成损伤而对损伤细胞无改善作用。表 1 补阳还五汤及其有效成分对正常和缺血再灌大鼠脑细胞膜序参数Ｓｏ 和Ｓｘ 的影响Ｔａｂ 1 ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆＢｕｙａｎｇｈｕａｎｗｕｄｅｃｏｃｔｉｏｎａｎｄｉｔｓｅｆｆ ｅｃｔｉｖｅｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓｏｎｔｈｅｏｒｄｅｒｐａｒａｍｅｔｅｒｓＳｘａｎｄＳｏｏｆｔｈｅｂｒａｉｎｃｅｌｌｍｅｍｂｒａｎｅｉｎｎｏｒｍａｌａｎｄｉｓｃｈｅｍｉａ ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎｒａｔｓ序号样品终浓度序参数序参数 (Ｓｘ-Ｓｏ)/ｍｏｌ·Ｌ- 1 /Ｓｏ /Ｓｘ × 101生理盐水 0 .6 839± 0 .0 0 830 .7384± 0 .0 0 352 ) 0 .5562芍药苷 2× 10 - 5 0 .6 82 8± 0 .0 0 4 6 0 .72 6 6± 0 .0 0 951 ) 0 .4 383芒柄花素 2× 10 - 5 0 .6 773± 0 .0 136 0 .72 38± 0 .0 1571 ) 0 .4 6 54紫檀烷苷 2× 10 - 5 0 .6 815± 0 .0 0 990 .7188± 0 .0 1112 ) 0 .3735槲皮素 2× 10 -
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