紫杉醇Taxol是一种从红豆杉科植物Taxus中提取出来的天然抗癌药物。它是Wani等首 次从太平洋红豆杉TaxusbrevifoliaNutt．的树皮中分离出来的犤１犦。１９ ９２年，美国FDA批准紫杉醇上市犤２犦，治疗卵巢癌、乳腺癌和肺癌等。由于红豆杉科植物生 长缓慢，树皮中紫杉醇含量又低（约万分之二）犤３犦，紫杉醇的需求量又十分巨大，然而红豆杉 资源在世界上非常有限，全世界约有红豆杉１１个种，我国虽有５个种，但分布量都非常稀少，因 此红豆杉的药用和资源保护形成了尖锐矛盾。为了解决药源紧缺状况，国内外学者为多渠道得到紫 杉醇做了大量研究，包括培育新品种、化学人工合成、组织培养和细胞培养等犤３犦。Strob el等从短叶红豆杉的树皮中分离出２００种微生物，其中有一种内生真菌Taxomycesa ndreanae犤１犦；Stierle等利用质谱等方法证实这种内生真菌在半合成的液体培 养基中能产生紫杉醇及其一些相关物质犤１犦。如果从我国的红豆杉资源中也能分离得到类似的内 生真菌，并进行人工发酵培养，从其培养物中提取、分离紫杉醇，就能为保护生态环境，为人类造 福产生积极的作用。为此，作者在这方面进行了初步的研究。图１紫杉醇对照品UV图Fig１U Vgraphofthecontroltaxol材料和方法材料、试剂和仪器东北红豆杉Ta xusCuspid-ataSiebetZucc取材于北京林业大学。紫杉醇标准品来自于中 国医学科学院药物研究所。分离试剂二氯化汞、乙醇和培养基材料葡萄糖、磷酸氢二钾、硫酸镁、 蛋白胨等为化学纯；化学提取分析试剂乙酸乙酯、丙酮、甲醇和乙腈等为分析纯。往返式摇床为日 制TLR-S-D型；高效液相色谱仪（HPLC）为Waters９９６型，ZORBAXRX -C１８柱。内生真菌的分离首先用自来水洗净红豆杉样品，用剪刀剪去其侧枝，将主杆切成长约 ５cm的小段，经０．５％升汞液浸泡约３min后，取出用无菌水洗净，放入７５％乙醇液中约 １～２min，再用无菌水反复洗净后待分离。分离前先用无菌滤纸吸净树段上的无菌水，按无菌 操作技术，切取或剪取红豆杉小块树皮置于放有土豆葡萄糖琼脂（PDA）固体培养基的培养皿中 ，分离后将培养皿置于２０～２５℃恒温培养箱中培养，待树皮表面长出白色菌丝后，将长出的菌 丝挑入新的PDA试管斜面培养基中。经过不断反复纯化培养即获得红豆杉内生真菌菌株。内生真 菌的液体培养将分离纯化后得到的真菌菌株进行摇床液体扩大培养，培养温度为２５～２８℃，摇 床速度１００～１１０r/min，培养时间４～６d。内生真菌的提取物分离及高效液相色谱的 定性鉴别采用乙酸乙酯－丙酮等提取东北红豆杉内生真菌培养物，提取物上硅胶柱及C１８硅胶柱 （ODS小柱）分离，各部分分离物采用高效液相色谱法作定性鉴别，以保留时间（Rt值）、对 照品叠加法和紫外图谱（UV图谱）进行比较分析。高效液相色谱条件为流动相甲醇－水－乙腈（ ２０∶４５∶３５），柱温４０℃，流速１ml/min。结果和讨论东北红豆杉内生真菌的形态 特征及生长特性从东北红豆杉的树皮中主要分离出３个真菌菌株，菌丝体均为白色，其中有一个菌 株有两种菌丝，即粗菌丝和细菌丝。菌丝显微观察多为分叉，有分隔，分叉的菌丝有的出芽形成球 形或椭圆形的芽孢。该菌株在PDA固体培养基上生长较快，一般５d左右就可长满直径为９cm 的培养皿。这些特征与StrobelG等报道的从短叶红豆杉和邱德有等报道的从云南红豆杉中 分离到的内生真菌非常相似犤１犦。该菌在往返式摇床和旋转式摇床中培养均能生长，但在往返式 摇床培养比在旋转式摇床培养生长要快，且第一、第二天生长最为迅速，以后生长能力逐渐下降。 这与培养基中作者所测残糖含量第三天急剧下降是一致的。有关内生真菌生长与培养基中营养成分 的关系将另作报道。东北红豆杉内生真菌培养物中紫杉醇类化合物高效液相色谱的定性分析采用高 效液相色谱法对东北红豆杉内生真菌培养物的提取分离物进行定性分析表明，东北红豆杉内生真菌 培养物提取物中含有与紫杉醇对照品UV图谱、Rt值较为接近的色谱峰，对照品Rt值为１３． ３９８（图１），而提取分离物为１３．３９６（图２），两者很接近，说明东北红豆杉内生真菌 培养物中含有紫杉醇类化合物的成分。从东北红豆杉内生真菌培养物UV图谱可以看出，其UV色 谱峰非常小，其它不明物的UV色谱峰较多，这说明在东北红豆杉树皮中分离得到的内生真菌紫杉 醇类化合物含量较低，其它化学成分较多。为了提高其含量，达到分离、提取，最终得到精制品的 要Auto-scaledchromatogram０．０３００．０２５０．０２００．０１ ５０．０１００．００５０．０００１３．３９８０．００２．００４．００６．００８．００１ ０．００１２．００１４．００１６．００１８．００２０．００MinutesAU求，还需进 一步进行菌种的筛选，或在培养基中添加能够刺激紫杉醇及其相关物质含量的成分，并进行菌株的 鉴定、发酵培养，并采用先进的化学方法（高效液相色谱法、气相色谱法、质谱、毛细管电泳等） 进行分析提取和药理学等研究。Auto-Scaledchromatogram０．００２０ ０．００１８０．００１６０．００１４０．００１２０．００１００．０００８０．０００６０ ．０００４０．０００２０．０００００．００２．００４．００６．００８．００１０．００１ ２．００１４．００１６．００１８．００２０．００Minutes１０．３４０１０．７９７ １３．３９６１７．２图２东北红豆杉内生真菌培养物中紫杉醇类化合物的UV图Fig２UVc hartoftaxolcompoundsfromthecultureofanendop hyticfungusfromthebarkofTaxusCuspidatasiebetZuccAU一种能产生紫杉醇类化合物内生真菌的分离@邵爱娟$中国中医研究院中药研究所生药室!北京100700
@林淑芳$中国中医研究院中药研究所生药室!北京100700
@张思巨$中国中医研究院中药研究所生药室!北京100700
@李晓明$中国中医研究院中药研究所生药室!北京100700
@黄璐琦$中国中医研究院中药研究所生药室!北京100700
@陈敏$中国中医研究院中药研究所生药室!北京100700
@吴志刚$中国中医研究院中药研究所生药室!北京100700
@戴如琴$中国中医研究院中药研究所生药室!北京100700
@刘丽$中国中医研究院中药研究所生药室!北京100700东北红豆杉;;内生真菌;;紫杉醇 类化合物;;高效液相色谱目的从东北红豆杉TaxusCuspidataSiebetZuc c树皮中分离能产生紫杉醇类化合物的内生真菌。方法采用无菌技术分离东北红豆杉树皮中的内生 真菌,并采用高效液相色谱(HPLC)等方法对该真菌培养物进行分析。结果从东北红豆杉树皮 中分离得到一种内生真菌,化学分析证明该真菌培养物内含有紫杉醇类化合物。结论东北红豆杉树 皮中含有能产生紫杉醇类化合物的内生真菌。邱德有,黄美娟,方晓华,等.一种云南红豆杉内生真菌的分离.真菌学报,1994,13(4):314-316
王润玲,陈涓.紫杉醇的研究及应用进展.中草药,1997,28(增刊):5-7
方起程,方唯硕.紫杉醇的研究进展.中草药,1997,28(增刊):1-5０．００１００． ０００８０．０００６０．０００４０．０００２０．０００００．００２．００４．００６．０ ０８．００１０．００１２．００１４．００１６．００１８．００２０．００Minutes１ ０．３４０１０．７９７１３．３９６１７．２图２东北红豆杉内生真菌培养物中紫杉醇类化合物 的UV图Fig２UVchartoftaxolcompoundsfromthecultu reofanendophyticfungusfromthebarkofTaxusCus pidatasiebetZuccAU一种能产生紫杉醇类化合物内生真菌的分离@邵爱娟$中国中医研究院中药研究所生药室!北京100700
@林淑芳$中国中医研究院中药研究所生药室!北京100700
@张思巨$中国中医研究院中药研究所生药室!北京100700
@李晓明$中国中医研究院中药研究所生药室!北京100700
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@陈敏$中国中医研究院中药研究所生药室!北京100700
@吴志刚$中国中医研究院中药研究所生药室!北京100700
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@刘丽$中国中医研究院中药研究所生药室!北京100700东北红豆杉;;内生真菌;;紫杉醇 类化合物;;高效液相色谱目的从东北红豆杉TaxusCuspidataSiebetZuc c树皮中分离能产生紫杉醇类化合物的内生真菌。方法采用无菌技术分离东北红豆杉树皮中的内生 真菌,并采用高效液相色谱(HPLC)等方法对该真菌培养物进行分析。结果从东北红豆杉树皮 中分离得到一种内生真菌,化学分析证明该真菌培养物内含有紫杉醇类化合物。结论东北红豆杉树 皮中含有能产生紫杉醇类化合物的内生真菌。邱德有,黄美娟,方晓华,等.一种云南红豆杉内生真菌的分离.真菌学报,1994,13(4):314-316
王润玲,陈涓.紫杉醇的研究及应用进展.中草药,1997,28(增刊):5-7
方起程,方唯硕.紫杉醇的研究进展.中草药,1997,28(增刊):1-5
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