人参总皂甙对心肌细胞缺血再灌注损伤的保护作用

机体细胞死亡有两种形式：一种是细胞在各种理化因素损害时发生的死亡，称为坏死；另一种是细胞在某种生理或病理情况下发生的有序的主动性的非炎症性细胞死亡（programmed cell death,PCD)。最近的许多研究表明心肌细胞凋亡是许多心血管疾病发生、发展的重要的细 胞学基础，在心肌细胞缺血再灌注（ischemia/reperfusion,I/R)损伤 中也有细胞凋亡的存在。药理研究证明人参总皂甙（Ginsenosides,GS)对心肌细 胞的缺血再灌注损伤有明显的保护作用。本实际利用体外培养的乳鼠心肌细胞缺血再灌注损伤的模 型，检测其中的细胞损伤及细胞凋亡，并加入不同浓度的GS干预，以探讨缺血再灌注损伤与细胞凋亡的关系及不同浓度的GS对其保护作用及可能机理。为临床上的缺血性心脏病中应用GS提供依据。1材料和方法1.1 实验动物出生1～3 d的SD乳鼠（由江西医学院实验动物中心提供）。1.2 主要实验仪器二氧化碳孵箱（SMEL-LAB型，美国）；倒置生物显微镜（85084，重庆光 学仪器厂）；医用净化工作台（XJ-875，苏州净化设备厂）；721分光光度计（上海医疗仪器三厂）。1.3主要实验试剂RPMI Medium 1640培养基（英国imperial laboratory)；小牛血清（上海华美公司）；胰蛋白酶（上海华美公司）；人参总皂甙（ 江医二附院制剂室提供）；LDH活性试剂盒（南京建成生物工程研究所）；MDA试剂盒（南京建成生物工程研究所）；总蛋白定量试剂盒（南京建成生物工程研究所）。1.4实验方法心肌细胞缺血及缺血再灌注损伤模型的建立：1）缺血模型：去除培养液，换用混合氮气［CO2∶N2=5∶95(V∶V)］饱和30 min的无糖培养液2 ml，充入混合氮气置换瓶内空气，密闭后置于培养箱中培养3 h，为缺血模型。2）缺血再灌注模型：在缺血模型后换用混合空气［空气∶CO2=5∶95（V∶V）］饱和的培养液2 ml，向瓶中充入混合空气置换残余氮气，置于5%CO2孵箱中继续培养1 h为缺血再灌注模型。1.5 实验分组培养心肌细胞贴壁生长，并产生有节律的搏动，将培养至第三代的心肌细胞配成106个/ ml浓度，随机分入24孔培养板内，实验共分15组（每组10孔），即：（1）正常培养组，（2）正常培养+GS（20mg/L)组，（3）正常培养+GS（40 mg/L)组，（4）正常培养+GS（80 mg/L)组，（5）正常培养+GS（160 mg/L)组，（6）缺血培养组，（7）缺血培养组+GS（20 mg/L)组，（8）缺血培养+GS（40 mg/L)组，（9）缺血培养+GS（80 mg/L)组，（10）缺血培养+GS（160 mg/L)组，（11）I/R组，（12）I/R+GS（20 mg/L)组，（13）I/R+GS（40 mg/L)组，（14）I/R+GS（80 mg/L)组，（15）I/R+GS（160 mg/L）组。1.6 实验检测1） 取各孔中上清液分别用丙酮酸法测定LDH活力，用TAB法测定MDA含量及用双缩脲法测定蛋白总量。2） 心肌细胞DNA电泳：将心肌细胞离心沉淀，收集心肌细胞，每组用100 mg，采用蛋白酶K37℃消化12 h，经酚氯仿抽取后，乙醇醋酸钠沉淀，用TE溶解DNA沉淀，加RNA酶A37℃消化15 min，再经酚氯仿抽取，乙醇醋酸钠沉淀，取5 mgDNA，以1.5%琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭染色，在紫外灯下观察电泳带。3） 电镜观察：取心肌细胞离心沉淀，以2.5%戊二醛固定，常规超薄切片，醋酸铀，柠檬酸铅染色后透射电镜观察。1.7 统计学处理计数资料用均数±标准差表示，同组间比较用方差分析，组间两两比较用Q检验。2 结果2.1 不同浓度GS对心肌缺血再灌注细胞损伤的保护作用正常组不同GS浓度之间均无显著性差异（P＞0.05)；除GS浓度160 mg/L时正常组与缺血组之间MDA含量无显著性差异（P＞0.05）外，其余相同GS浓 度时正常组、缺血组及I/R组之间均有显著性差异（P＜0.01)（见图1～3）。2.2DNA电泳结果正常培养组不论是否加用了GS或不同浓度的GS，其电泳图呈正常组织DNA电泳 带型，为一条大分子DNA片段（见封二图1）。在缺血组中除一条大分子DNA片段外，还可见 大分子DNA下弥散着一条密度均匀的拖尾条带，此电泳带像常见于细胞坏死的DNA电泳带（见封二图2）。在I/R组中见DNA电泳带呈典型的梯状结构（LadderPattern)，即DNA断裂成基数为180～200 bp的片段，数条DNA片段形成似直立的云梯，随着GS浓度的增加，梯状带逐渐不明显（见封二图3）。2.3 电镜观察结果电镜下见1～5组大部分为正常心肌细胞，6～10组见大量坏死心肌细胞，未见明显 凋亡心肌细胞，11～15组不仅可见大量坏死细胞及细胞碎片，还可见散在的凋亡细胞，随GS 浓度增加，凋亡细胞逐渐减少。坏死心肌细胞肿大，线粒体肿胀，嵴断裂或呈空泡状（见封二图4 ）。凋亡细胞早期线粒体、细胞膜等无明显变化，可见核染色质边聚，稍后可见核固缩，胞浆浓集，最后分裂为凋亡小体（见封二图5、6）。3讨论3.1 心肌细胞的缺血再灌注损伤与心肌细胞凋亡细胞的死亡方法有二种，一种是细胞坏死，另一种是细胞 凋亡，细胞凋亡与细胞分化、增殖一样是细胞生命的基本特征之一。两者的动态平衡维持着机体内 环境的相对稳定［1］。细胞凋亡的异常是多种疾病发生、发展的重要原因之一。以往的研究以为 缺血再灌注损伤是因氧自由基和钙超载（Ca2+overload）所致的细胞坏死，最近的一 些研究表明缺血再灌注损伤中亦有细胞凋亡的参与［2］。在本次实验中可见缺血组及缺血再灌注 组中LDH活性、MDA含量及蛋白总量均明显升高，说明缺血及再灌注损伤主要是由细胞坏死而 引起，在单纯缺血组中，DNA电泳无梯状带，电镜下亦未见明显的凋亡细胞，可见单纯缺血不引 起明显细胞凋亡，而在缺血再灌注中，DNA电泳带呈明显的梯状，电镜下也见较多的凋亡心肌细 胞，可见在缺血再灌注中有心肌细胞凋亡的存在。目前的研究认为在缺血再灌注损伤中引起细胞凋 亡的介质与引起细胞坏死的介质一样，也是由大量氧自由基［3］及钙超载［4］介导。氧自由基 是机体内氧分子的不全代谢产物，主要包括超氧阴离子，过氧化氢，羟自由基和单线态氧等。大量 氧自由基对生物大分子结构有广泛作用，不仅能攻击生物膜中的不饱和脂肪酸，破坏细胞膜、线粒 体膜等生物膜的完整性、增加其通透性而引起细胞损伤、细胞坏死，而且对核物质的作用可以导致 碱基修饰、碱基丢失、单链和双链DNA的断裂、DNA交联、癌基因的激活或失活等，特别是染 色质中位于核小体间的组蛋白成分是其攻击的主要目标，细胞凋亡时DNA被降解为整数倍数的D NA片段，可能与此有关［5］。Ca2+增加时，与ATP一起作用于染色质，使原来折叠得很紧的染色质变松散，暴露出水解部位，便于DNase水解［6］。3.2人参总皂甙对缺血及缺血再灌注损伤中的细胞坏死和细胞凋亡的保护作用人参总皂甙是中药人参的提 取物，含有30余种单体，主要有人参皂甙Rb1、Rb2、Re、Rf1、Rg等成份，既往的 药理研究证明人参总皂甙具有清除氧自由基，拮抗钙离子通道，调整前列环素/血栓素A2（PG I2/TXA2）比值等作用，具有抗心脑缺血再灌注损伤的作用。本实验结果显示人参总皂甙能 显著减轻缺血及再灌注损伤，减少其中的细胞坏死和细胞凋亡，且这种作用与人参总皂甙浓度密切相关，在0～160mg/L的浓度范围内对心肌缺血再灌注损伤有直接保护作用，该保护作用随其浓度增加而加强，其 抗细胞坏死和细胞凋亡作用的机理可能为其具有的抗氧自由基及钙离子通道拮抗的功能［7］。人参总皂甙对心肌细胞缺血再灌注损伤的保护作用@陈图刚$江西医学院第二附属医院心内科!江西南昌 330006
@罗伟$江西医学院第二附属医院心内科!江西 南昌 330006
@程晓曙$江西医学院第二附属医院心内科!江西 南昌 330006缺血再灌注损伤;;细胞凋亡;;人参总皂甙利用体外培养的心肌细胞缺血再灌注损伤 的模型，检测其中的细胞损伤及细胞凋亡，并加入不同浓度的人参总皂甙干预，以探讨缺血再灌注 损伤与细胞凋亡的关系及不同浓度的人参总皂甙对其保护作用。结果：（1）人参总皂甙对正常培 养的心肌细胞无明显影响；（2）单纯缺血损伤中无明显心肌细胞凋亡，而缺血再灌注损伤中有细 胞凋亡的参与；（3）人参总皂甙对缺血再灌注损伤中的细胞坏死和细胞凋亡均有显著的保护作用，其保护作用在一定浓度范围（0～160mg/L)内与其浓度呈正相关。<1> Wyllie A H.Apoptosis and the regulation of cell numbers in normal and neoplastic tissues:an overview.Cancer Metastasis Rev,1992,11:95-103.
<2> Agarwal M L,Larkin H E.Phospholipase activation triggers apoptosis in photosensitized mouse lymphoma cells.Cancer Res,1993,53:5897-5902.
<3> Forrest V J,kang Y H,Mc clain D E,et al.P53-dependent apoptosis in the absence of transcriptional activation of P53-tarpet genes.Natur

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