中药ＮＺ系木犀科女贞属植物 ,是中国民间常用中药之一 ,民间验方用于治疗口腔炎和牙周炎 ,有关中药ＮＺ的化学成分、抗炎及免疫作用未见详细报道。本文报告了ＮＺ有效化学部位ＺＤ的提取以及抗炎免疫作用。1 临床资料1.1 药物提取1.1.1 材料 原药 :中药ＮＺ采自武汉市区 ,经湖北中医学院陈科立教授鉴定为木犀科女贞属植物ＮＺ ;夏季采摘 ,自然曝晒后密封室温保存 ;碾槽内碾碎 ,过 4 0目筛。试剂 :薄层层析用硅胶Ｇ (2 0 0～30 0目 ,青岛海洋化工厂 ) ;羧甲基纤维素钠 (上海化学试剂采购供应站经销 ) ;环己烷 ,乙酸乙酯均为分析纯。1.1.2 方法 薄层层析 (ｔｈｉｎｌａｙｅｒｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙＴＬＣ)及显色 ,取硅胶 10 ｇ ,分次加入 1%羧甲基纤维素钠水液 30ｍｌ,研磨均匀至无气泡 ,用手动铺板10 5℃活化 1ｈ ;干燥器内保存备用。取样以毛细管点于以上自制板上 ,以环己烷 :乙酸乙酯 (2∶1)展开至 15ｃｍ ,取出挥尽展开剂。取展开板 ,10 %硫酸乙醇溶液喷雾 ,10 5℃加热 5ｍｉｎ ,紫外分析仪下观察。提取分离得 5 .8ｇ白色提取物 ,药理预试证明具有抗炎作用。Ｌｉｅｂｅｒｍａｎｎ反应 :样品溶于乙酸酐中 ,加入浓硫酸一滴 ,观察样品的颜色变化<1> 。1.1.3 结果 ＺＤ的薄层层析结果显示ＺＤ具有两个主要成分 ,比ＮＺ的浸膏成分简化了很多 ,结果见图 1。Ｌｉｅｂｅｒｍａｎｎ反应结果显示ＺＤ的颜色呈现黄→红→蓝→紫→绿色等变化 ,最后褪色 ,证明ＺＤ属于皂甙类物质。1.2 动物实验1.2 .1 材料1.2 .1.1 动物和试剂 昆明种小鼠 ,Ｗｉｓｔａｒ大鼠 ,由同济医科大学实验动物中心提供。二甲苯 (ＡＲ ,武汉联碱厂 ) ,阿拉伯胶 (Ｂｐ80Ｓ - 2 2 5广州市医药公司化玻批发部分装 ) ,消炎痛 (ＩＥＣＴ ,江苏金坛市制药厂 ) ,盐酸左旋咪唑 (ＴＬＨ中国国营海安制药厂 ) ,植物血凝素 (ＰＨＡ中国广州 ) ,角叉菜胶 (ｃａｒ ｒｅｇｅｅｎｉｎ ,ｓｉｇｍａＵＳＡ) ,醋酸泼尼松 (ＰＡＴ浙江医药股份有限公司仙居制药厂 )。 图 1 ＺＤ与ＮＺ浸膏ＴＬＣ结果紫外光下所见 ,1为ＺＤ ,2为ＮＺ浸膏 ,可见ＺＤ的组成比浸膏已简化很多 ,由两个主要成份构成1.2 .1.2 仪器 精密扭力天平ＪＮ -Ａ(上海第二天平仪器厂 )。1.2 .1.3 药物的配制 精密称取ＺＤ 7.962 5 ｇ ,用1%的阿拉伯胶溶液配制成 175ｍｌ,分别取出 5 0ｍｌ、2 5ｍｌ用 1%阿拉伯胶溶液配成终体积 10 0ｍｌ,得到ＺＤ3(4 4ｍｇ/ｍｌ 4 4 0ｍｇ/ｋｇ) ;ＺＤ2 (2 2ｍｇ/ｍｌ 2 2 0ｍｇ/ｋｇ) ;ＺＤ1(11ｍｇ/ｍｌ110ｍｇ/ｋｇ) ;用 1%阿拉伯胶溶液将ＰＡＴ配成 0 .2ｍｇ/ｍｌ (2ｍｇ/ｋｇ)。 4℃保存。2 结果2 .1 抗炎作用2 .2 对二甲苯性小鼠耳肿胀的影响 取雄性昆明小鼠 5 0只 ,按随机化原则分成 5组 ,每组 10只。分别给予 1%阿拉伯胶溶液 (ｃｏｎｔｒｏｌ) ,ＺＤ1,ＺＤ2 ,ＺＤ3,消炎痛 ,均按体重 0 .2ｍｌ/ 10 ｇ灌胃 ,ｉｇ .给药4ｄ ,每日 1次 ,末次灌胃 30ｍｉｎ后 ,用 5 #注射针头于小鼠右耳两面涂二甲苯 0 .0 5ｍｌ/只致肿 ,左耳不涂为正常耳 ,15ｍｉｎ后脱颈椎处死小鼠 ,用 6ｍｍ打孔器冲下左耳和右耳同一部位的圆片 ,于精密扭力天平上称重 ,右耳重量减去左耳重量为肿胀度。结果显示 ,三种剂量的ＺＤ对二甲苯引起的小鼠耳廓肿胀均有显著的抑制作用 (Ｐ <0 .0 5 ) ,作用随剂量加大而减弱 ,见表 1<2 > 。2 .3 对角叉菜胶性大鼠足跖肿胀的影响 取Ｗｉｓ ｔａｒ雄性大鼠 35只 (12 0～ 15 0 ｇ) ,按随机化原则分为5组 ,分别给予 1%阿拉伯胶 (Ｃｏｎｔｒｏｌ) ,ＺＤ1,ＺＤ2 ,ＺＤ3,ＰＡＴ。每组均按 1ｍｌ/ 10 0 ｇ给药 ,每日灌胃一次 ,连续给药 7ｄ。用排水法测定每鼠左后肢正常足跖容积 ,用记号笔在大鼠左后肢踝关节周围做一标记 ,将大鼠后足浸入容器中至后足踝关节标记处 ,观察注射器排出的水体积 ,即为足跖容积指标Ｖ1。表 1 ＺＤ对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响组别剂量 (ｍｇ/ｋｇ) 耳廓肿胀度 (ｍｇ)肿胀抑制率 ( % )Ｃｏｎｔｒｏｌ 4.92± 1.7ＺＤ1110 0 .6 5± 0 .3 86 .79ＺＤ2 2 2 0 1.4± 1.3 71.5 4ＺＤ3 440 1.92 5± 1.32 6 0 .87ＩＥＣＴ 73.17± 0 .3 3 5 .5 7 注 :与对照组比 , Ｐ <0 .0 5 Ｐ <0 .0 1 Ｐ <0 .0 0 1 测量正常足跖容积后 ,灌胃给药 ,末次给药 1ｈ后于大鼠左后足掌用 0 .2 5ｍｌ注射器注射 1%角叉菜胶 0 .0 5ｍｌ于足跖皮下 ,随后于注射后 1ｈ、2ｈ、5ｈ由专人测量容积Ｖ2 ,肿胀度为Ｖ2～Ｖ1。 结果显示ＺＤ1可于注射角叉菜胶后 1ｈ、2ｈ显著减轻大鼠左后足跖的肿胀度 ,ＺＤ2可于注射角叉菜胶后 1ｈ显著减轻大鼠左后足跖的肿胀度 ,肿胀抑制率为 65 .4 6% ;ＺＤ3虽然有抑制角叉菜胶足肿胀的趋势 ,但统计学上无明显意义 ,表明作用随剂量加大而减弱 ,见表 2 <3> 。2 .4 对大鼠棉球肉芽肿的影响 灭菌脱脂干棉球(2 0ｍｇ/只 ) ,上加青霉素和链霉素混合液 0 .2ｍｌ(每毫升含青霉素 80 0Ｕ ,链霉素 65 0Ｕ) ,5 0℃烘干。表 2 ＺＤ对大鼠角叉菜胶性足肿胀的影响 ( ｘ±ｓ,ｎ =7)药物剂量 (ｍｇ/ｋｇ) 肿胀度 1ｈ 2ｈ 5ｈ 肿胀抑制率 ( % )1ｈ 2ｈＣｏｎｔｒｏｌ— 0 .386± 0 .12 10 .414± 0 .2 340 .15 7± 0 .15 1——ＺＤ1114 0 .12 9± 0 .16 0 0 .314± 0 .16 80 .171± 0 .1116 5 .5 82 4.15ＺＤ2 2 2 80 .0 42 9± 0 .0 787 0 .14 3± 0 .0 976 0 .2 0 0± 0 .10 0 88.896 5 .46ＺＤ3 45 5 0 .2 43± 0 .12 7 0 .2 5 7± 0 .172 0 .15 7± 0 .113 37.0 5 37.92ＰＡＴ 2 0 .0 42 9± 0 .0 5 35 0 .0 714± 0 .0 75 6 0 .10 0± 0 .0 5 77 88.8982 .75 注 :与Ｃｏｎｔｒｏｌ组相比 , Ｐ <0 .0 5 体重 12 0～ 15 0 ｇＷｉｓｔａｒ大鼠 ,雄性 ,4 2只 ,按随 机数字表分为六组。腹腔注射戊巴比妥钠 8ｍｇ/10 0 ｇ麻醉。在各鼠的左右腹股沟用碘酒消毒 ,75 %酒精脱碘 ,各切开 1ｃｍ长小口 ,用眼科镊子将棉球植入皮下 ,缝合皮肤。从手术当日起 ,第一组用 1%阿拉伯胶 (Ｍｏｄｅｌ)灌胃 ,第二组用ＺＤ1灌胃 ,第三组用ＺＤ2灌胃 ,第四组用ＺＤ3灌胃 ,第五组用ＰＡＴ灌胃 ,第六组用ＴＬＨ灌胃 ,连续 8ｄ。第 8ｄ断头处死大鼠 ,打开原切口 ,将棉球连同周围结缔组织仪器一起取出 ,剔除脂肪组织 ,放烘箱中 60℃ 12ｈ烘干称重。将称得的重量减去棉球重量即得肉芽肿得的重量。 肉芽肿模型可产生与炎症后期病理变化相似的肉芽组织增生 ,是常用的抗炎模型之一 ,结果显示与Ｍｏｄｅｌ组相比 ,ＺＤ2和ＺＤ3可显著抑制大鼠棉球肉芽肿的重量 (Ｐ <0 .0 5 ) ,见表 3<3> 。表 3 ＺＤ对大鼠棉球肉芽肿的影响 ( ｘ±ｓ,ｎ =7)组别剂量 (ｍｇ/ｋｇ) 肉芽肿重量抑制率 ( % )Ｍｏｄｅｌ— 77.92 9± 18.46 1ＺＤ1110 72 .393± 7.940 7.10ＺＤ2 2 2 0 5 2 .96 4± 9.0 6 9 3 2 .0 4ＺＤ3 440 5 5 .96 4± 9.6 2 3 2 8.19ＰＡＴ 2 40 .92 9± 4.949 47.48ＴＬＨ 0 .486 2 .6 43± 12 .874 19.6 2 注 : Ｐ <0 .0 52 .5 免疫作用 对小鼠ＰＨＡ刺激淋巴细胞转化的影响 ,取健康昆明小鼠 5 0只 ,雌雄各半 ,体重 18～2 2 ｇ ,按随机数字表分为 5组 ,分别给予 1%阿拉伯胶溶液 (ｃｏｎｔｒｏｌ) ,ＺＤ1,ＺＤ2 ,ＺＤ3,ＴＬＨ。连续给药13ｄ ,从第 14ｄ起每日在小鼠左后腿肌注 10ｍｇ/ｋｇ ,连续 3ｄ ,第 2 0ｄ剪尾采血涂片 ,瑞氏染色 ,双盲法由专人在油镜下计数转化的淋巴细胞和计算淋巴细胞转化率 ,结果经ＳＡＳ软件包卡方检验显示 ,ＺＤ各剂量均可提高ＰＨＡ刺激的淋巴细胞转化率 ,与对照组相比 ,差别具有显著性 (Ｐ <0 .0 1) ,作用随剂量增加而增加 ,这说明ＺＤ体内可提高机体的免疫能力 ,促进淋巴细胞转化 ,见表 4 <4 > 。表 4 ＺＤ对小鼠ＰＨＡ刺激淋巴细胞转化的影响组别剂量 (ｍｇ/ｋｇ) 淋巴细胞转化率转化提高率 ( % )Ｃｏｎｔｒｏｌ— 16 %—ＺＤ1110 2 8% 75ＺＤ2 2 2 0 37% 131.2 5ＺＤ3 440 39% 14 3 .75ＴＬＨ
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