阐明低氧性肺动脉高压形成机制一直是肺心病防治的关键。血管内皮生长因子 (vascularendothe lialgrowthfactor ,VEGF)是一种具有旁分泌和自分泌机制的生长因子 ,具有促进内皮细胞有丝分裂、新生血管形成 ,增加血管通透性的作用<1> 。为探讨VEGF在肺动脉高压形成中的作用 ,我们复制了慢性常压低氧高二氧化碳肺动脉高压大鼠模型 ,观察VEGF受体拮抗剂苏拉明 (suramin)对慢性肺动脉高压的影响 ,旨在寻求一种新的防治途径。1 材料与方法1.1 动物模型的复制 二级♂SD大鼠 30只 ,体重180～ 2 5 0 g(温州医学院动物中心提供 ) ,随机分成 3组。①正常对照组 (N组 ,n =10 ) ,作为常压氧下的对照 ;②低O2 高CO2 4wk组 (F组 ,n =10 ) ,置于自制的常压低O2 高CO2 饲养舱内 (舱内O2 浓度 0 0 9～ 0 11,CO2 浓度 0 0 5～ 0 0 6 ) ,每天 8h ,每周 6d ,连续 4wk。每天低氧前腹腔注射 0 5ml生理盐水③低O2 高CO2 4wk +苏拉明组 (S组 ,n =10 ) ,每天低氧前腹腔注射苏拉明 (7 5mg·kg- 1·d- 1,0 5ml) ,饲养条件同F组。苏拉明购自美国Sigma公司。1.2 肺动脉平均压和右心室重量比的测定和标本的留置 大鼠腹腔注射 1%戊巴比妥钠 (35mg·kg- 1)麻醉 ,行颈正中切口 ,自颈外静脉插管至肺动脉 ,并行颈总动脉插管 ,分别连接YL 3型、YL 4型Tab 1 ChangesofmPAP ,mCAP ,RV/(LV +S) ,levesofVEGFinserumandinlungtissue( x±s,n =10 )Group mPAP/kPamCAP/kPa RV/LV +S VEGFofserum/ng·L- 1VEGFoflungtissue/ng·L- 1N 1.2 9± 0 .15 17.2 2± 0 .60 0 .2 2± 0 .0 2 93 .11± 13 .2 2 3 83 .3 1± 3 0 .65F 2 .2 9± 0 .18△ 18.99± 0 .870 .3 8± 0 .0 2 △ 2 0 5 .0 6± 3 3 .70 △ 65 9.2 7± 13 2 .14 △S 1.5 4± 0 .2 9 19.0 8± 0 .710 .2 4± 0 .0 4 93 .5 9± 9.64 471.42± 47.0 5 △P <0 0 1vsgroupN , P <0 0 5 , P <0 0 1vsgroupF压力传感器 ,输入SJ 4 2型生理记录仪测取平均肺动脉压 (meanpulmonaryarterialpressure ,mPAP)和平均颈动脉压 (meancarotidarterial pressure ,mCAP)。从颈动脉插管中抽取 2ml血液 ,- 4℃30 0 0r·min- 1离心 15min ,取上清液 - 70℃保存备测。放血处死动物 ,分离右心室 (RV)、左心室 +室间隔 (LV +S) ,吸干分别称重并计算出两者的比值(RV/LV +S) ,以反映右心室肥大的指标。在右肺门水平横切面取 2mm3大小肺组织 ,2 5 g·L- 1戊二醛作前固定 ,10g·L- 1饿酸作后固定 ,常规染色 ,半薄切片定位 ,H 6 0 0型透射电镜观察。其余肺组织 ,液氮保存备测。1.3 组织匀浆和血清VEGF含量检测 称取肺组织 10 0mg ,加入预冷的 10 0 %甲醇溶液 (W /V =1∶10 ) ,冰浴匀浆 5min ,取匀浆液 30 0 0r·min- 1低温离心 10min ,取上清液备测。肺组织和血清VEGF含量检测采用ELISA检测试剂盒 (美国R&DSYS TENS公司 )。具体操作严格按照药盒说明书进行。1.4 肺细小动脉VEGF免疫组化检测 (SABC法 ) 一抗 :VEGF兔抗大鼠多克隆抗体 (购自武汉博士德生物工程有限公司 ) ,二抗及检测试剂盒为SABC工作液 ,DAB显色 ,苏木精套染 ,阳性结果呈棕黄色。每只大鼠任选 1张肺组织切片 ,每张切片随机选取直径 5 0～ 2 0 0 μm的肺细小动脉 10条 ,用图像分析仪心肺血管分析软件 (华东理工大学研制 )测取所选血管管壁平均吸光度值 (lightdensity ,LD)作为肺动脉管壁VEGF的相对含量。1.5 肺细小动脉VEGFmRNA原位杂交检测1.5 .1 寡核苷酸探针 VEGF地高辛标记的多聚寡核苷酸探针序列 (1) 5′ GCTCTACCTCCACCATGCCAAGTGGTCCCA 3,(2 ) 5′ GACCCTGGTGGACATCTTCCAGGAGTACCC 3,(3) 5′ GCAGCTTGAGTTAAACGAACGTACTTGCAG 3。1.5 .2 杂交过程 石蜡切片脱蜡至水 ,3%过氧化氢室温处理 10min去除内源性过氧化氢酶 ,3%柠檬酸稀释的胃蛋白酶消化 ,37℃ 30s ,暴露mRNA核酸片段 ,滴加探针 ,封闭 ,滴加生物素化鼠抗地高辛 ,滴加SABC液 ,滴加生物素化过氧化氢酶 ,DAB显色 ,苏木精套染 ,阳性结果呈棕黄色。用图像分析仪心肺血管分析软件检测肺动脉管壁VEGFmRNA的相对含量 (方法同上 )。1.6 统计学处理 实验数据以 x±s表示 ,SPSS10 0统计软件进行分析。采用组间t检验。2 结果2 .1 各组平均肺动脉压、体循环压和右心室重量比的比较 F组mPAP、RV/ (LV +S)均高于N组 (P<0 0 1) ,而S组mPAP、RV/ (LV +S)则低于F组(P <0 0 1)。各组间mCAP差异无显著性 (P >0 0 5 ,Tab 1)。2 .2 各组大鼠血清和肺组织匀浆VEGF含量的比较 F组大鼠血清、肺组织VEGF的浓度均高于N组 (P <0 0 1) ,S组与F组比较 ,其血清和肺组织匀浆VEGF的浓度均下降 (P <0 0 1;P <0 0 5 ,Tab1)。2 .3 慢性低O2 高CO2 和苏拉明对大鼠肺细小动脉超微结构的影响 电镜下 ,N组大鼠肺细小动脉内膜、中膜、外膜、内外弹力板清晰 ,内皮细胞扁平 ,中膜有 1～ 2层平滑肌细胞 ,平滑肌细胞之间有散在的胶原纤维。F组大鼠肺细小动脉内皮细胞向管腔内突起 ,内皮基底变窄 ,形成立方上皮 ,部分呈柱状 ,平滑肌细胞增生明显 ,胶原纤维密集 ,内弹力板不均匀增厚 ,吞饮小泡增多 (Fig1、2 )。S组与F组比较 ,其内皮细胞趋向于扁平 ,基底变宽 ,平滑肌细胞增生减少 ,胶原纤维沉积减少 (Fig 3、4 )。Fig 3 ,4 ProliferationofsmoothcellandcollagenousfiberingroupSwasrelived (electronmicroscopy,× 8K)2 .4 各组大鼠肺细小动脉VEGF相对含量的变化 F组大鼠肺细小动脉VEGF相对含量高于N组(P <0 0 1) ,S组大鼠肺细小动脉VEGF相对含量与F组比较则降低 (P <0 0 5 ,Tab 2 )。Tab 2 ChangesofLDofVEGF ,VEGFmRNA( x±s,n =10 )Group LDmLDN 0 .0 73± 0 .0 13 0 .0 84± 0 .0 12F 0 .116± 0 .0 3 0 △△ 0 .14 0± 0 .0 41 △△S 0 .0 91± 0 .0 2 0 0 .0 99± 0 .0 0 8 P <0 0 5 , P <0 0 1vsgroupF ,△△ P <0 0 1vsgroupN2 .5 各组大鼠肺细小动脉VEGFmRNA相对含量的变化 F组大鼠肺细小动脉VEGFmRNA相对含量高于N组 (P <0 0 1) ,S组大鼠肺细小动脉VEGFmRNA相对含量与F组比较则降低 (P <0 0 1,Tab 2、Fig 5、6 )。Fig 5 Pulmonaryarteriolewallofhypoxiahypercapniarat (insituhybridization ,× 160 )werestronglystained3 讨论肺血管重建是慢性低氧性肺动脉高压主要的血Fig 6 Thestainofsuramingrouppulmonaryarteriolewall(insituhybridization ,× 160 )wassignificantlyreduced管变化特征和难以逆转的重要因素。研究发现 ,在低氧等各种刺激因子作用下 ,肺动脉平滑肌细胞增殖以及胶原等细胞外基质在管壁大量沉积是肺动脉重建的最主要的原因<2 > 。本实验以常压低氧高二氧化碳复制肺动脉高压大鼠模型 ,低氧 4wk后大鼠mPAP升高 ,提示肺动脉高压的形成。RV/ (LV +S)比值的增加 ,进一步说明存在右心室肥大。电镜下肺细小动脉中膜平滑肌细胞增生 ,中膜、外膜胶原纤维大量沉积 ,说明在低氧性肺动脉高压形成过程中出现明显的肺血管重建 ,与文献报道一致<3> 。 低氧导致肺血管重建的机制较为复杂。现已发现低氧可引起肺血管内皮细胞合成和释放多种细 胞生长因子并参与肺血管平滑肌细胞的增生和细胞表型转化的调控。VEGF是一种新型的有丝分裂原,在正常机体中VEGF维持组织器官发育和其正常的功能状态的作用 ,而在低氧状态下 ,内皮细胞上
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