高静水压对内皮细胞产生不对称二甲精氨酸的影响及葛根素对其 作用

血管内压的升高会导致血管内皮细胞(VECs)功能和形态发生改变,促进血管重构、动脉粥样硬 化等高血压的病理过程。内皮功能障碍是高血压等心血管病的始发事件,而一氧化氮(NO)的降低又是内皮功能受损最早存在的异常表现<1>。近年发现人体内存在的不对称二甲精氨酸(ADMA)具有抑制一氧化氮合酶(NOS)的作用, 能够抑制NO的合成,被称为内源性NOS抑制剂。然而有关高血压与ADMA的关系尚不明了。 中药葛根素(Puerarin)对血管内皮细胞具有保护作用,但其机制尚不明了。本研究通过 体外高血压模型,观察高静水压(HPC)培养的内皮细胞产生ADMA的情况及葛根素干预后的变化,以探讨高血压时VECs的病理生理及葛根素对血管内皮保护的机制。1　材料与方法11　药物与试剂　葛根素冻干粉(山东瑞阳制药有限公司生产,批号:0 2 112 10 ,10 0mg/支) ,DMEM、胶原酶和胰蛋白酶(上海生化研究所提供) ,胎牛血清(Gibco公司生产) ,NO、内皮素(ET)、血管紧张素转换酶(ACE)试剂盒(南京建成生物工程研究所) ,ADMA标准品(Sigma公司生产) ,高效液相色谱仪(日本岛津公司生产) ,混合气体(上海比欧西气体工业有限公司生产) ,自行改制带有压力表和气囊的高压容器。1 2　方法1 2 1　人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的原代、传代培养　采用改良的Jaffe<2 > 法。无菌条件下取足月顺产新生儿脐带4～6条(2 5～30cm) ,D -Hank液冲洗干净,用胰蛋白酶消化法获得HUVECs,收集至培养瓶中,加入含2 0 %胎牛血清的DMEM培养液,放入37℃、5 %CO2 孵箱中培养,2 4h换液,待细胞长成亚融合状态时传代并进行形态学和Ⅷ因子鉴定。取3～6代生长良好的HUVECs进行实验。1 2 2　实验分组　将HUVECs制成细胞悬液,按4 .0×10 4个细胞/孔的细胞密度接种于2 4孔板,加入含10 %胎牛血清的DMEM培养基置于37℃、5 %CO2 孵箱中进行培养,待HUVECs生长呈亚融合状态时(2 4～4 8h)换无血清培养液,继续培养12～2 4h。然后按实验要求分组:①大气压组(0kPa) :加DMEM培养液;②高静水压组:压力2 3.9kPa;③高压+葛根素组:压力2 3.9kPa条件下同时分别加入葛根素(5 0 0mg/L、10 0 0mg/L) ,即PueI组和PueⅡ组。每组8孔,继续培养2 4h ,收集细胞及培养液。1 2 3　观测指标及测定方法1 2 3 1　ADMA及左旋精氨酸(L -arg)　培养液经萃取提纯,以高效液相色谱法(HPLC)进行检测。测定条件:流动相(磷酸缓冲液∶甲醇=70∶30 ) ;样品经固相萃取OPA衍生后进样,检测波长Eλ338μm ,Em 4 2 5 μm。1 2 3 2　NO浓度　采用酶法测定,按试剂盒说明操作。1 2 3 3　ET及ACE活性　使用放免试剂盒,采用特异性RIA法测定。1 2 3 4　细胞内Ca2 + 浓度　将内皮细胞制成1×10 6个/mL细胞悬液,加入3μmol/LFluo 3-AM ,37℃避光30min ,缓冲液洗3次,弃上清液,缓冲液重悬细胞,加入CaCl2 至终浓度为1.8mmol/L ,上流式细胞仪检测,在散点图Time/FL(Fluo/AM )中设测量门R读取平均荧光强度。根据(Ca2 + )i的绝对值=Kd(F -Fmin) / (Fmax-F)计算。Kd=4 0 0nmol/L ,为Fluo 3- /Am与Ca2 + 结合经校正后解离常数;Fmax为加入A2 3187后测得的最大值;Fmin为加入EDTA测得的最小值。1 3　统计学方法　所有数据以 x±s表示,多组间比较采用方差分析,多组间两两比较采用q检验。采用SAS 6 .12软件操作,以P <0 .0 5为有显著性差异。2　结　　果高静水压组ADMA ,ET含量及Ca2 + 浓度、ACE活性均高于大气压组,而NO含量则与此相反,但合成NO的底物L arg无明显变化;葛根素干预后,ADMA ,ET含量及ACE活性、细胞内Ca2 + 浓度较高静水压组明显降低,NO含量增加,且呈一定的浓度依赖性。具体结果见表1。3　讨　　论表1　各组检测指标的变化( x±s)组别ADMA/ (μmol/L) NO/ (μmol/L) ET/ (ng/L)L -arg/ (μmol/L) ACE/ (IU/L) (Ca2 + )i/ (CB/nmol·L- 1 )大气压组0 .81±0 .1 1 92 .93±9.92 50 .58±7.52 73 .45±8.83 2 3 .36±2 .8832 2 .30±57.90高静水压组6 .0 8±0 .69①4 8.2 1±6 .30 ①98.69±5 .71 1 ①69.71±8.35 38.1 7±4 .80 ①4 73 .40±63 .50 ①高压+PueI组4 .1 2±0 .51 ②74.2 5±7.65②68.42±7.1 2 ②72 .66±8.56 2 5 .39±3 .81 ③3 52 .70±57.97②高压+PueⅡ组3 .42±0 .54③82 .34±9.55③62 .57±7.86③70 .0 1±8.2 72 5 .77±3 .65③3 0 8.78±45 .37③　　注:①与大气压组比较,P <0 .0 1 ;②与高静水压组比较,P <0 .0 5 ;③与高静水压相比较,P <0 .0 1。　　一氧化氮合酶(NOS)是NO合成的限速酶,投以外源性NOS抑制剂抑制NO的合成, 可导致内皮依赖性血管舒张功能障碍,致动脉血压升高。近年发现人体内存在的ADMA具有抑制NOS作用,引起人们极大的重视<2> 。3 1　高血压与ADMA　ADMA竞争性抑制NO的合成,使内皮依赖性的血管舒张功能出现障碍, 并促使细胞增殖反应,因此在高血压的发生发展中起重要作用。于麻醉状态下的豚鼠静脉给予提取的人体内ADMA1～30mg/kg ,可导致剂量依赖性血压升高;持续静脉注射3mg/ (kg·h)的ADMA ,当其血浓度升高9倍时,收缩压可升高约15 % <3 > 。Gardiner等<4>给大鼠静推1～10 0mg/kg的ADMA ,引起剂量依赖性升压反应,同时可见肾动脉、肠系膜动脉、下肢血管收缩。在5min内静推10 0mg/kg的ADMA后,平均血压可升高4 0mmHg(1mmHg =0 .133kPa)以上,其后静脉注射0 .3mg/ (kg·h)的NO供体药物S -亚硝基-N -乙酸青酶胺或S -亚硝基谷胱甘肽,虽使平均动脉压降至正常,然而不能逆转缩血管效应。这些试验证明静脉应用A DMA可抑制NO合成,诱致血压升高,其作用可被给予的NO供体及扩血管药物所抵消。VEC s覆盖于血管的内表面,直接受到血管内压力包括剪切力、循环应力、流体静水压的影响。Goonasekera等<5>发现原发性高血压患者血浆ADMA显著升高,NO减少,且血浆高ADMA水平与高内皮细胞活化因子(VCAM - 1)浓度明显相关。虽然高血压实验动物和患者血清ADMA减少,但多种因素可以升高血清ADM A浓度,如高血脂、冠心病、肾功能障碍等,因此判断高血压患者ADMA增高与血压的因果关系 ,及其对血压的影响程度时非常困难。本实验观察到静水压本身可使VECs分泌ADMA增加,导致NO合成减少,ACE及ET均显著升高,而合成NO的底物L-arg则无明显变化。表明高血压时NO代谢障碍肯定与ADMA环节有关,证明高血压与ADMA两者互为因果,共同促进疾病的进展。3 2　葛根素对高静水压培养HUVECs产生ADMA的影响葛根素的有效成分为葛根黄酮,是从野葛根中提取的异黄酮化合物,它对心血管具有保护作用<6-8> 。研究表明葛根素能减轻脂质过氧化对内皮细胞的损害,减少丙二醛和凝血烷的分泌,维护内皮细胞 膜结构的稳定。笔者选用葛根素对体外高静水压培养的HUVECs进行干预,结果显示葛根素对血管内皮细胞有良好的保护作用,能抑制HUVECs产生ADMA,使NO合成增加,ET减少,细胞内(Ca2 + )i下降,从而改善内皮细胞功能。从细胞水平说明葛根素能减轻高压状态下ADMA/L -arg -NO途径代谢紊乱,减轻高血压对内皮功能的损害,进而促进内皮细胞的增殖和修复,改善缺血缺 氧的损伤过程,阻止动脉粥样硬化的进程。高静水压对内皮细胞产生不对称二甲精氨酸的影响及葛根素对其作用@李菊香$江西医学院第二附属医院!江西南昌330006
@汪进益$江西医学院第二附属医院!江西南昌330006
@苏海$江西医学院第二附属医院!江西南昌330006
@饶芳$江西医学院第二附属医院!江西南昌330006
@程晓曙$江西医学院第二附属医院!江西南昌330006
@罗伟$江西医学院第二附属医院!江西南昌330006高静水压;;内皮细胞;;不对称二甲精氨酸;;葛根素目的　观察高静水压培养的人脐静脉内皮细胞 (HUVECs)产生不对称二甲精氨酸 (ADMA)的情况及中药葛根素干预后的变化。方法　采用改良的Jaffe法培养原代HUVECs,取生长良好的 3～ 6代HUVECs用于实验 ,分为大气压组 (加等量DMEM培养液 )、高静水压组(2 3.9kPa)和高静水压 +葛根素组。测定上清液中ADMA、左旋精氨酸 (L -arg)、一氧化氮(NO)和内皮素 (ET)的浓度及血管紧张素转换酶 (ACE)的活性。结果　高静水压组ADMA及ET含量、细胞内钙 (Ca2 + )浓度及AC