0引言血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor, VEGF)是一种糖基化分泌性多肽因子,具有促进血管内皮细胞分裂,诱发血管形成及增加血管 通透性的功能犤1,2犦。已经证实,VEGF是高特异性的促进血管内皮细胞有丝分裂的因子, 是新生血管形成的中心调控者。VEGF与一些缺血性疾病(如脑缺血,肢体缺血)密切相关犤3 -7犦。有研究表明,VEGF的分泌受到一系列激素,生长因子和小分子物质一氧化氮,佛波酯 以及低氧、低血糖等因素的影响犤8,9犦。本试验采用中药血清药理学方法犤10,11犦观察 复方中药大川芎丸对体外人脐静脉血管内皮细胞VEGF分泌的影响,旨在探讨大川芎丸治疗缺血 性疾病的药理机制。1材料和方法设计:采用成组对照研究设计。地点和材料:试验在四川大学华 西医学动物试验中心及华西医院内科实验室完成。清洁级中国本兔2只,雄性,每只2kg,由四 川大学华西医学动物实验中心提供。新鲜脐带,成都市妇幼保健院提供。大川芎丸标准提取物Ⅰ号 (主要成分为川芎和天麻按4∶1比例所炼制的浸膏)由北京中医药研究院提供。Ⅰ型胶原酶(S igma公司),胎牛血清(Gibco公司),M-199培养液(Gibco公司),胰酶( EML公司),人VEGFSandwichELISA试剂盒(CHEMICON公司)。He raeusPEW-B2.1型,CO2培养箱(Heraeus公司),YJ-1300医用超 净工作台(苏州净化设备公司),550酶标分析仪(BIO-RAO550),酶标洗板机(B IO-RAOMODEL1575),倒置相差显微镜(OLYMPUSCK2)。参与者:研究 设计者、资料收集者、干预实施者为本文全部作者。干预措施:人脐静脉内皮细胞(humanu mbilicalveinen-dothelialcell,HUVECs)培养:采用改良 的Jaffe法犤12,13犦,在无菌条件下取健康产妇正常分娩3h以内胎儿脐带30～40 cm,用Hank’s液反复冲洗至无血迹,向脐静脉内灌注1g/L胶原酶3～5mL,钳住两 端,置37℃水浴中消化18～20min,收集消化液,并用含胎牛血清(fetalcalf serum,FCS)的M-199培养液冲洗脐静脉,冲洗液并入消化液中,1000r/mi n离心10min,弃上清,将细胞悬于含200g/L胎牛血清的M-199培养液,置37℃ ,50mL/LCO2培养箱培养,24h换液,待细胞长成融合状态,经形态学和免疫细胞化学 方法鉴定(Ⅷ因子相关抗原抗体阳性)确定为内皮细胞后再进行传代培养。用第3代生长良好的H UVECs进行试验。内皮细胞的鉴定:形态学:相差显微镜下,细胞呈多角形,单层铺路石状排 列,或短梭形细胞呈鱼贯样排列。Ⅷ因子抗原:经抗辣根过氧化物酶法检查,原代培养的内皮细胞 胞浆内均有棕色沉淀,以核周最为明显,胞核不着色,细胞界限清楚(见图1)。含药血清的制备 :试验白兔2只,分为试验组和对照组各1只,试验组以大川芎丸临床推荐用量(0.583g/ kg)的5倍作为本试验的单次给药剂量,对照组给以相同体积的生理盐水。两组均采用管喂给药 方式,连续管喂3d,2次/d,早晚各1次,分别于末次灌胃1h后,腹主动脉采血,3000 r/min,离心20min,分离血清,经56℃,30min灭活,0.22μm微孔滤膜过 滤,除菌得到大川芎丸含药血清和空白对照血清,-20℃保存备用。试验分组:选第3代生长良 好的内皮细胞,按2×107L-1密度接种于96孔板,每孔含200g/L胎牛血清的M-1 99培养液200μL,置37℃,50mL/LCO2培养箱中,待细胞贴壁生长24h后,换 无血清培养液同步24h,弃上清液,按以下试验分组要求加入试验培养液。①常氧培养组:不含 兔血清对照组(Ⅰ组):200μL100g/LFCS的M-199。空白兔血清对照组(Ⅱ组 ):20μLFCS+20μL空白兔血清+160μLM-199。低剂量含药血清组(Ⅲ组) :20μLFCS+20μL低剂量含药兔血清+160μLM-199。②低氧培养组:不含兔 血清对照组(Ⅳ组)200μL100g/LFCS的M-199。空白兔血清对照组(Ⅴ组): 20μLFCS+20μL空白兔血清+160μLM-199。低剂量含药血清组(Ⅵ组):2 0μLFCS+20μL低剂量含药兔血清+160μLM-199。常氧培养组置于37℃,5 0mL/LCO2培养箱中,低氧培养组置于37℃,10mL/L,50mL/LCO2,94 0mL/LN2培养箱中培养24h后,每组中随机抽取6孔,收集上清液,离心去掉细胞后,- 20℃保存待测。培养上清液中VEGF水平的测定:采用酶联免疫吸附法(enzyme-li nkedimmunoadsordentassay,ELISA)检测,具体步骤按试剂盒说 明书进行,用酶标仪在波长490nm下测定吸光度值,建立VEGF校正曲线,计算出各组培养 上清液中VEGF水平。主要结局观察指标:在常氧和低氧培养条件下,不含兔血清,空白含兔血 清,低剂量含药血清的培养上清液中VEGF分泌水平统计学分析:由第一作者采用SPSS10 .0统计学软件进行统计学处理。数据以x珔±s表示,组间比较采用t检验或t'检验。2结果 2.1常氧培养条件下HUVECsVEGF分泌水平常氧培养条件下,Ⅰ组培养上清中检测到低 浓度的VEGF犤(135.71±50.01)ng/L犦,说明在无理化因素干预的情况下, HUVECs的VEGF的自分泌维持在一个较低水平。2.2缺氧是刺激HUVECsVEGF 分泌的一个有利因素Ⅳ组VEGF浓度犤(853.57±14.29)ng/L犦与Ⅰ组犤(1 35.71±50.01)ng/L犦相比,培养上清液中VEGF水平明显升高,有显著性差异 (t'=30.862,P<0.001),VEGF平均值上升约6倍,说明缺氧条件下,HU VECs的VEGF分泌水平显著升高。2.3大川芎丸对HUVECs的VEGF分泌水平的影 响Ⅱ组犤(132.14±54.64)ng/L犦与Ⅰ组,Ⅴ组犤(860.71±87.86 )ng/L犦与Ⅳ组犤(853.57±14.29)ng/L犦相比,培养上清中VEGF水平 无显著性差异(t=0.108,P>0.05),说明不含药空白血清对HU-VECsVEG F的分泌无明显影响。Ⅲ组犤(150.00±53.57)ng/L犦与Ⅰ组相比,培养上清中 VEGF水平差异无显著性差异(t=0.436,P>0.05),说明在常氧条件下,大川芎 丸含药血清对HUVECsVEGF的分泌无明显影响。Ⅳ组与Ⅵ组犤(839.29±113. 57)ng/L犦的VEGF水平差异无显著性意义(t'=0.279,P>0.05),说明 低氧培养条件下,含药血清对HUVECsVEGF的分泌无明显影响。3讨论本试验观察到低氧 能有效促进体外培养人脐静脉内皮细胞VEGF的分泌,这与目前诸多相关研究的结论一致。迄今 认为,缺氧是VEGF/VEGFR表达的最主要的调节因素。其促进VEGF分泌的机制较为复 杂。在缺氧条件下,VEGF的mRNA,蛋白和生物活性均有所增加;缺氧时低氧诱导因子(H IF-1)可通过与VEGF基因5’端低氧反应因子结合,提高转录率;在缺氧响应过程中,V EGFmRNA的稳定性也起着关键作用,VEGFmRNA的半衰期在正常条件下较短,仅30 ～40min,但在缺氧条件下可增加到6～8h,这说明VEGF受缺氧的调节不仅发生在转录 水平,同时也发生在转录后水平。另外,在缺氧时还存在一个与信号通路有关的现象:缺氧可以诱 导c-fos和jun家族基因的表达。jun家族的同二聚体和fos/jun异二聚体构成的 AP-1转录因子在VEGF表达调控方面起重要作用。缺氧时v-fos和c-jun的共同表 达可刺激VEGF的转录。中药川芎主要化学成分含川芎嗪,异亮氨酸酐,川芎哚,川芎内酯等, 具有活血行气,祛瘀通脉,祛风止痛的功能,临床上用于缺血性疾病的治疗有效犤14犦。结论: 低氧能有效促进体外培养人脐静脉内皮细胞VEGF的分泌。本试验选择浓度下的大川芎丸含药血 清对VEGF的分泌无明显干预作用。在本试验选择浓度下的大川芎丸含药血清对体外培养人脐静 脉内皮细胞VEGF的分泌,在常氧和低氧培养条件下均无明显干预作用。加大含药血清浓度能否 观察到大川芎丸的干预作用需要从进一步的试验中得到结论。此外本试验结果也提示存在另一种假 设,即川芎治疗缺血性疾病的药理作用机制可能并未通过VEGF这一新生血管形成的中心调控者来实现,而是通过其他途径发挥其治疗作用。(图1见插图19-2页)大川芎丸对血管内皮细胞中血管内皮生长因子分泌水平的影响@周沐科$四川大学华西医院神经内科!四川省成都市610041
@何俐$四川大学华西医院神经内科!四川省成都市610041
@吴波$四川大学华西医院神经内科!四川省成都市610041
@杨明$成都中医药大学药学院!四川省成都市610072内皮,血管/细胞学;;脐静脉;;内 皮生长因子;;川芎/药理学;;低氧目的:研究大川芎丸对体外培养人脐静脉内皮细胞中血管内 皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF) 分泌水平的影响,为临床用于缺血性疾病的治疗提供实验依据。方法:以体外培养人脐静脉内皮细 胞为研究对象,分别在常氧和低氧培养条件下,采用中药血清药理学方法,在试验组培养液中加入 含药血清,对照组加入空白血清,酶联免疫吸附法(ELISA)检测各组培养液中VEGF水平 。结果:低氧培养条件下VEGF分泌水平犤(853.57±14.29)ng/L犦较常氧培 养条件下犤(135.71±50.01)ng/L犦有明显升高(t'=30.862,P<0.001);试验组
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