一氧化氮 (NO)是由一氧化氮合酶 (NOS)以L 精氨酸 (L arg)和分子氧为底物形成的 ,它可以调节血管张力 ,抑制血小板粘附和聚集。已证实AD MA是一种合成NO底物L arg的类似物 ,能竞争性抑制NO的合成 ,被称为内源性NO合酶抑制剂<1 > 。氧化型低密度脂蛋白 (ox LDL)通过抑制内皮细胞NO的合成 ,导致动脉粥样硬化 ,但NO的减少是否与ADMA有关 ,尚未见报道。葛根素 (Puerarin)对血管内皮细胞具有保护作用 ,能减轻病理情况下内皮细胞的损伤 ,增加NO的合成 ,但其机制尚不明了。本实验通过体外ox LDL培养人脐静脉内皮细胞 ,并以中药葛根素进行干预 ,观察葛根素能否减轻ox LDL对内皮细胞功能的损害作用 ,进一步探讨葛根素保护内皮细胞的机制。1 材料与方法1 1 主要试剂与仪器葛根素冻干粉 (山东瑞阳制药有限公司 ,批号0 2 1 1 2 1 0 ,1 0 0mg/支粉针剂 ) ,DMEM、胶原酶和胰蛋白酶 (上海生化研究所 )、胎牛血清 (Gibco公司 )、NO、ET试剂盒 (南京建成生物工程研究所 )、ADMA标准品 (Sigma公司 )、低密度脂蛋白 (Lipoprotein ,LDL) (Sigma)、CO2 细胞培养箱 (NuairCFAutoflow ,Japan)、ITM 2倒置显微镜 (Olympus,Japan)、VisiprepTM固相萃取真空多歧管装置 立盖式 (Supel co公司 )、日本岛津高效液相色谱仪 ,WDL 95色谱工作站Version 3.1 0。1 2 细胞培养采用改良的Jaffe<2 > 法 ,无菌条件下取健康正常分娩新生儿脐带 4～ 6条 ( 2 5～ 30cm) ,D Han冲洗干净脐静脉管腔 ,用胶原、胰蛋白酶消化法获得HUVECs,加含 2 0 %胎牛血清的DMEM培养液于37℃、5 %CO2 的孵箱中培养 ,2 4h换液 ,待细胞长成融合状态 ,进行细胞学鉴定 ,确定为内皮细胞后再进行传代培养。将 3～ 4代生长良好的HUVECs用于实验。1 3 实验分组根据ox LDL的有无分为 2组 ,每组又分为对照、葛根素Ⅰ ( 0 .5mg/ml)和葛根素Ⅱ ( 1 .0mg/ml) 3组 ,每小组 8个培养孔。1 4 实验步骤1 4.1 ox LDL制备 将 1mgLDL置于Cu2 +( 1 0μmol/L)的DMEM液中 ,37℃温育 2 0h ,加ED终此氧化反应。制备的ox LDL经 4g/L的琼脂糖凝胶电泳 ,苏丹黑B染色后观察迁移率以验证氧化程度。电泳分析表明 ,经过氧化修饰的ox LDL电泳迁移率较LDL明显增加 ,符合试验要求。1 4.2 HUVECs体外ox LDL培养 将生长良好的第 3～ 6代内皮细胞置于DMEM培养基中孵育( 37℃、5 %CO2 ) ,0 .2 5 %胰蛋白酶消化制成细胞悬液 ,按每孔 4.0× 1 0 5个细胞密度接种于 2 4孔细胞培养板 ,置于 37℃、5 %CO2 孵箱中进行培养 ,待HUVECs生长呈亚融合状态 ( 2 4～ 48h)换无血清DMEM培养液 ,加ox LDL 1 5 0mg/L。同时按空白对照组、葛根素Ⅰ组 ( 0 .5mg/ml)、葛根素Ⅱ组 ( 1 .0mg/ml)分别加入葛根素 ,继续培养 2 4h ,留取上清液及细胞待检测 ,重复 3次取平均值。1 4.3 HUVECs的体外无ox LDL培养 取同样的细胞悬液 ,试验以每孔 4.0× 1 0 5个细胞的细胞数接种于 2 4孔板 ,置于 37℃、5 %CO2 孵箱中进行培养 ,待HUVECs生长呈亚融合状态 (约 2 4～ 48h)换为无血清DMEM培养液。按实验要求分空白对照组、葛根素Ⅰ ( 0 .5mg/ml)、葛根素Ⅱ组( 1 .0mg/ml)分别加入葛根素 ,并继续培养 2 4h ,留取上清液及细胞待检测 ,重复 3次取平均值。1 5 观察指标及检测方法1 5 .1 NO浓度测定 用一氧化氮试剂盒 (酶法 )测定。1 5 .2 内皮素 (ET)和血管紧张素转换酶 (ACE)测定 使用内皮素放免试剂盒和ACE试剂盒 ,操作按说明。1 5 .3 二甲精氨酸 (ADMA)及L arg测定 培养液经萃取提纯 ,以高效液相色谱法进行检测。测定条件 :流动相 (磷酸缓冲液 甲醇 =70∶30 ) ;样品经固相萃取OPA衍生后进样 ,检测波长Eλ338μm ,Em 42 5 μm。1 5 .4 流式细胞仪检测细胞内Ca2 +浓度 将内皮细胞用Krebs Ringer缓冲液配成重悬细胞 ,加入CaCl2 至终浓度为 1 .8mmol/L ,上机检测。在散点图Time/FL(Fluo/AM)中设测量门R读取平均荧光强度。根据
i的绝对值 =Kd(F -Fmin) /(Fmax-F)。Kd=40 0nmol/L为Fluo 3/Am与Ca2 +结合经校正后解离常数 ,Fmax为加入A2 31 87后测得的最大值 ,Fmin为加入EDTA测得的最小值。1 6 数据统计实验数据以均数±标准差表示 ,均数之间差别检验以t检验分析 ,P <0 .0 5表示差异统计学意义。2 结 果在该实验无ox LDL培养的 3组中 ,葛根素Ⅰ和葛根素Ⅱ与对照组相比 ,虽然VECs产生NO的量增加 ,分泌ADMA的量有所升高 ,但无统计学意义。ox LDL培养组与无ox LDL组相比 ,VECs产生NO的量显著减少 ,ADMA、ET的量和 i 浓度以及ACE活性则明显增加 ;加用葛根素干预后 ,VECs分泌NO的量有所增加 ,而ADMA、ET的量和i则降低 ,ACE活性下降 ,与对照组相比 ,葛根素Ⅰ的差异有统计学意义 (P <0 .0 5 ) ,且随浓度增加作用更明显。而L arg的浓度变化则没有显著性差异 ,表明NO的减少是由于ADMA的增加 ,而非NO合成底物的耗竭。结果见表 1与表 2Tab 2 Effectsofox LDLandpuerarinonsecretionofL argand ifromendothelialcells(x±s ,n =8)No .GroupsConc .(mg/ml)L arg( μmol/L) Ca2 + (CB/nmol·L- 1 )ACE(U/ml)no ox LDLControl 13 8.90± 3 .60 3 2 3 .3 0± 5 6.90 2 1.3 6± 2 .88PuerarinⅠ 0 .5 13 2 .80± 2 .2 0 3 2 8.5 0± 5 7.70 2 3 .18± 3 .0 4PuerarinⅡ 1.0 13 5 .70± 6.40 3 16.60± 5 3 .5 0 2 1.98± 2 .76ox LDLControl 13 7.3 0± 4.60 487.60± 66.40 3 4.76± 4.84 PuerarinⅠ 0 .5 13 5 .5 0± 4.70 2 82 .70± 75 .3 0 △ 2 3 .46± 2 .3 1△PuerarinⅡ 1.0 13 9.40± 4.40 2 3 2 .5 0± 73 .3 0 △△ 2 2 .95± 3 .0 5 △ P <0 .0 1vscontrolofno ox LDLgroups,△ P <0 .0 5 ,△△ P <0 .0 1vscontrolofox LDLgroups3 讨 论3.1 ox LDL对VECs合成ADMA的影响血管内皮细胞损伤和功能失调是动脉粥样硬化 (AS)发生的基础 ,由于内皮损伤而继发引起脂质浸润、平滑肌细胞大量增殖AS病变。LDL发生氧化修饰形成的ox LDL具有细胞毒性作用 ,可以导致内皮损伤、促进平滑肌细胞增殖、血小板积聚以及单核细胞对内皮细胞粘附 ,在内皮细胞损伤中占重要地位 ,被认为是AS的启动及发展因子<3> 。Phohl等<4> 研究显示ox LDL能够与内皮细胞膜结合生成过多的脂质过氧化物 ,抑制内皮细胞一氧化氮合酶 (NOS)的活性 ,使得NO生成下降。已证实ADMA是一种合成NO底物L arg的类似物 ,能竞争性抑制NO的合成 ,被称为内源性NOS抑制物。从人尿中提取的ADMA能抑制从J774小鼠巨噬细胞制取的NOS的活性 ,且在 1～ 30 0 μmol/L的AD MA范围内 ,NO合成呈剂量依赖性减少<5> 。本实验结果发现ox LDL培养的内皮细胞产生NO减少 ,ADMA浓度增加 ,而合成NO的底物L arg浓度与无ox LDL组比 ,却无明显的变化。表明L arg在内皮细胞内含量丰富 ,以该物质的消耗不能解释NO的减少 ,而ADMA的浓度却显著升高 ,说明ADMA在氧化损伤内皮功能中起重要介导作用。3.2 葛根素对体外ox LDL条件培养HUVECs产生ADMA的影响葛根素是从豆科植物野葛根中提取的异黄酮化合物 ,它对心血管的保护作用已被证实<6 9> 。研究表明葛根素能够减轻脂质过氧化对内皮细胞的损害 ,减少丙二醛 (MAD)和凝血烷 (TXA2 )的分泌 ,维护内皮细胞膜结构的稳定。本研究选用葛根素对体外ox LDL条件培养的HUVECs进行干预 ,结果显示葛根素对血管内皮细胞有着良好的保护作用 ,能够抑制外源性ox LDL对培养的脐静脉内皮细胞产生ADMA ,使NO合成增加 ,ET减少 ,细胞内i下降 ,从而改善内皮细胞功能。从细胞水平说明葛根素能减轻LDL发生氧化修饰形成
More summaries about the 葛根素对oxLDL培养血管内皮细胞内源性一氧化氮合酶抑制物代谢的研究