冰茶栓 (原名“神农戒毒栓”) ,是根据传统中医药基本理论组方、精选的戒毒方 ,是由纯天然中药冰片、茶叶、蛇毒、桂枝等经过精细加工而成 ,具清热解毒、扶正祛邪、镇痉止痛等功效。冰茶栓作为非替代治疗药物已应用于阿片类药物依赖的临床治疗 ,但对其减轻戒断症状作用的分子机理尚缺乏研究。本研究采用免疫细胞化学技术测定吗啡依赖大鼠模型动物和采用冰茶栓干预后的大鼠蓝斑神经元Fos蛋白表达的变化 ,旨在揭示冰茶栓治疗阿片类戒断症状的分子机理。1 材料与方法1 1 动物健康雄性SD(Spraguedawley)大鼠 2 1只 (由浙江中医学院动物中心提供 ) ,体重 (2 0 0～ 2 4 0 ) g ,随机分为 3组 ,即NS组、造模组和冰茶栓组。笼养于基本恒温 (2 2℃ )、恒湿 (70 %湿度 )、12h昼夜交换的清洁饲养室内。实验前适应性喂养2d ,整个实验过程中饮水及进食自由。1 2 试剂与药品冰茶栓 实验用原配方结晶粉 (配方 :科博肽 80mg ,咖啡因 14 0mg ,冰片 6 0mg ,桂油 33 3mg)由浙江中医学院药理教研室提供 ;吗啡 批号 :(90 )卫药准字X - 10 0号 ,北京四环制药厂生产 ;纳络酮 批号 :0 0 0 30 1,沈阳第一制药厂生产 ,由华东医药公司提供 ;Fos蛋白免疫组化染色试剂盒 由北京中山生物技术有限公司提供。1 3 实验方法1 3 1 建立吗啡依赖大鼠模型<1 > 将大鼠随机分为 3组 ,每组 7只。分别设置为第 1组 :NS组 ;第 2组 :造模组 ;第 3组 :冰茶栓组。后 2组以剂量递增法形成吗啡依赖鼠 ,吗啡SC每天 3次 (8∶30、14∶30、2 0∶30 ) ,剂量为 5、10mg/kg各 4天 ,15、2 0mg/kg各 3天 ,给药至 15天上午 8∶30。NS组每次SC等量的生理盐水。1 3 2 冰茶栓等干预及促瘾试验 于末次吗啡注射 2小时后 ,给予大鼠第 3组冰茶栓 5 0 4mg/kg肛门给药 ;第 1组和第 2组 :等容的空白基质栓进行干预 ,30min后各组SC纳络酮 4mg/kg进行促瘾试验。1 3 3 Fos蛋白免疫化学试验<2 > 纳络酮促瘾试验 2小时后断头取大鼠桥脑部分 ,固定、脱水 ,连续冠状石蜡切片 ,厚度 2 0 μm。抽取部分切片 ,经HE染色后在光镜下确认蓝斑。切片预处理、PBS漂洗、加入兔抗鼠Fos抗体血清 (1∶4 0 0 )室温孵育 15min ,PBS漂洗 3次 ,加生物素标记的羊抗兔IgG(1∶2 0 0 )孵育 15min ,PBS漂洗 3次 ,加ABC复合物 (1∶10 0 ) ,PBS漂洗 3次 ,用DAB -H2 O2 液显色 ,复染 ,封片。采用视野评分法读片 ,每一样本取 2张脑片 ,在 10× 2 0和 10× 4 0放大倍数下 ,每一切片用目镜网格任选 2 5个视场进行观察 ,并对每一视场的着色强度进行分级 ,染色强度分为 0级(无 )、1级 (轻度 )、2级 (中度 )、3级 (高度 )。1 3 4 给药方法 冰茶栓 :肛门给药。1 3 5 数据处理 免疫细胞化学结果用 q检验。2 结 果2 1 冰茶栓对吗啡依赖大鼠蓝斑Fos蛋白表达的影响见表 1。表 1 NS组和造模组对蓝斑Fos蛋白表达的比较免疫细胞化学着色强度分级0级 1级 2级 3级 qP值造模组 0 0 164 47 <0 0 1冰茶栓组 0 5 2 0 4 0 7◇ <0 0 1NS组 610 0 5 76#<0 0 1 注 : 与冰茶栓组比较 ,◇与NS组比较 ,#与造模组比较3 讨 论本研究采用皮下给药法建立吗啡依赖大鼠模型。实验发现 ,吗啡依赖大鼠戒断时 ,其蓝斑的Fos蛋白的免疫反应活性明显增高 ,使用冰茶栓干预后Fos蛋白免疫反应活性明显下降 ,提示冰茶栓能抑制吗啡依赖大鼠蓝斑核的Fos蛋白的表达 ,而Fos蛋白的表达发生改变 ,将影响神经递质的合成。从而对戒断症状产生控制作用。蓝斑核是脑中主要的去甲肾上腺素能核团 ,以往的电生理研究发现 ,急性给予吗啡能抑制蓝斑核神经元的放电率 ,慢性持续给予吗啡 ,蓝斑核逐渐对吗啡的急性作用产生耐受 ,放电率逐渐恢复到正常水平。这种正常水平需要吗啡的持续维持 ,即对吗啡产生依赖 ,如果突然中止或给予拮抗剂 ,会导致蓝斑核神经元的放电率升高几倍。同时 ,实验动物会出现戒断症状。蓝斑核的这些变化 ,说明其在介导阿片类药物行为效应的重要性<3> 。原癌基因c-fos被认为是细胞核内信号传导的“第三信使” ,在神经系统的信号传导中通过调节某些特殊基因的表达而使短时程信号发挥长时程效应。正常情况下 ,细胞内的c -fos及其Fos蛋白水平很低 ,在基本的分子水平是不易检测到的 ,但通过药物的诱导可引起细胞内的激活。有些实验结果发现 ,给予吗啡依赖大鼠纳洛酮使其出现戒断行为时 ,其蓝斑核的Fos蛋白的免疫反应活性明显增高 ,说明吗啡戒断时蓝斑核的原癌基因c -fos的表达明显增强 ,进而调节续发的基因表达 ,大鼠表现出一系列的戒断症状。中枢神经系统c -fos的表达水平反映神经元生理状态的变化 ,可用来确定特定药物处理后被激活或抑制的神经元分布情况。冰茶栓能抑制吗啡依赖大鼠戒断症状及其蓝斑Fos蛋白的表达 ;但冰茶栓对Fos蛋白下调基因的调控机理有待今后进一步研究。冰茶栓对吗啡依赖大鼠蓝斑Fos蛋白表达的影响@饶芳$浙江中医学院!浙江杭州310053
@杨午鸣$浙江中医学院!浙江杭州310053
@楼航芳$浙江中医学院!浙江杭州310053
@王泽时$浙江中医学院!浙江杭州310053冰茶栓;;吗啡依赖;;蓝斑;;Fos蛋白目的 :研究冰茶栓对吗啡依赖大鼠蓝斑Fos蛋白表达的影响。方法:采用连续15dSC吗啡,建立 大鼠吗啡依赖模型,分成3组:造模组、NS组和冰茶栓组。各组用纳洛酮促瘾后,取桥脑蓝斑切 片,进行Fos蛋白免疫组化实验。结果:吗啡依赖大鼠经冰茶栓干预后,蓝斑Fos蛋白免疫反 应活性明显低于造模组。结论:冰茶栓能抑制吗啡依赖大鼠戒断症状及蓝斑Fos蛋白的表达。<1> 纪家涛.吗啡依赖大鼠模型的建立
.第二军医大学学报,1997,18(1):81.
<2> 李静.洛非西定抑制吗啡依赖蓝斑Fos蛋白的表达.中国药物依赖性杂志,2000,9(3):177.
<3> 吴建华,金国章.SPD和THP对蓝斑去甲肾上腺素能神经元自发放电的影响.生理学报,1995,47(6):601.国家九五攻关项目 目的:研究冰茶栓对吗啡依赖大鼠蓝斑Fos蛋白表达的影响。方法:采用连续15dSC吗啡, 建立大鼠吗啡依赖模型,分成3组:造模组、NS组和冰茶栓组。各组用纳洛酮促瘾后,取桥脑蓝 斑切片,进行Fos蛋白免疫组化实验。结果:吗啡依赖大鼠经冰茶栓干预后,蓝斑Fos蛋白免 疫反应活性明显低于造模组。结论:冰茶栓能抑制吗啡依赖大鼠戒断症状及蓝斑Fos蛋白的表达 。<1> 纪家涛.吗啡依赖大鼠模型的建立.第二军医大学学报,1997,18(1):81.
<2> 李静.洛非西定抑制吗啡依赖蓝斑Fos蛋白的表达.中国药物依赖性杂志,2000,9(3):177.
<3> 吴建华,金国章.SPD和THP对蓝斑去甲肾上腺素能神经元自发放电的影响.生理学报,1995,47(6):601.国家九五攻关项目
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